MAIT细胞在慢性HBV感染患者中的表达及临床意义

薛 红， 居林玲， 沈建东， 田李均， 明 芳， 邵建国， 卞兆连,

南通大学附属南通第三医院 1.重症感染科；2.肝病研究所；3.介入科；4.重症医学科；5.消化科，南通 226006

我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染大国，有60%的人口发生过HBV感染，7.2%转变为慢性HBV感染，随着病情的进展，逐渐演变为肝硬化，甚至肝功能衰竭，是当今社会一个严重的公共卫生问题，给全世界带来了很大的经济负担[1]。然而，直至目前，HBV感染慢性化严重程度的具体机制仍不明确，是临床研究的热点。大量研究报道，其可能与机体免疫系统密切相关，如T细胞[2]、B细胞、树突状细胞(dendritic cell, DC)[3]数量或功能异常导致机体防御系统功能异常，不能有效地清除感染的HBV。

黏膜相关恒定T(mucosal associated invariant T, MAIT)细胞是1993年Porcelli及其同事发现的，属于天然免疫样细胞[4]，富集在人肝脏，与恒定自然杀伤T细胞(natural killer T cells, NK)具有许多相似之处。正常情况下，MAIT细胞占人类肝脏T细胞总数的45%，但当发生缺血、缺氧、炎症刺激等情况时，能够迅速转移到由细菌感染或其他促炎性刺激引发的炎症部位，导致外周血MAIT细胞水平减少[5]。MAIT细胞是肝脏重要免疫细胞，外周血MAIT细胞缺乏可能反映慢性肝病进展程度，参与HBV感染的免疫学发表机制[6]。本研究选取HBV感染患者85例，旨在探讨MAIT细胞评估HBV感染不同阶段慢性肝病严重程度的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年8月至2019年8月在我科诊治的85例HBV感染患者，包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者30例、乙型肝炎肝硬化(HBV-related liver cirrhosis, LC)患者25例(代偿期肝硬化15例和失代偿期肝硬化10例)、HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV related acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)30例。

1.2 诊断标准所有诊断病例均参考《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》[7]及《肝衰竭诊治指南2018年版》中慢加急性肝衰竭的诊断标准[8]。排除标准：合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，自身免疫性肝病，酒精性肝病，人类免疫缺陷病毒，合并肝癌者；既往有免疫调节治疗史；孕妇、哺乳期妇女；合并有如心、脑、肺、肾等其他严重疾病患者。健康对照组：HBsAg阴性，肝功能正常，无慢性疾病，近期无感染史等。所有健康对照者均从我院体检中心进行正常体检者中筛选。随访3个月HBV-ACLF患者的生存情况，将病情好转出院及稳定3个月者列为好转组(n=19)，将病情危重而自动出院或在3个月内死亡者列为死亡组(n=11)。所有研究对象均签署知情同意书，同意参加本次研究及样本采集。本研究获得了南通市第三人民医院伦理委员会的批准(伦理批准号：EL2018002)。

1.3 试剂Ficoll密度梯度淋巴细胞分离液购自美国GE公司(批号：17-1440-02)，二甲基亚砜(DMSO)购自碧云天生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，PBS购自索莱宝公司。APC鼠抗人CD161及FITC鼠抗人CD3购自美国BD公司。抗人TCR Vα7.2抗体购自美国Biolegend公司。

1.4 方法

1.4.1 外周血单个核细胞的分离：用Ficoll密度梯度离心法抽取和分离外周血5 ml。将5 ml新鲜全血在3 000 r/min和20 ℃下离心10 min。收集浅黄色涂层相间层，然后放置在1.5 ml离心管中。浅黄色的液体和等量的PBS混合在一起。然后，将3 ml Ficoll放入15 ml离心管中，在其上分层稀释的黄色层，在400 rcf和20 ℃下离心30 min，无刹车。将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)吸出后放置到一个新的离心管中。加入5倍体积PBS洗涤PBMCs，然后在300 rcf和20 ℃下离心10 min，去除上清液。最后，用质量浓度为100 g/L的二甲基亚砜将胎牛血清悬浮在胎牛血清中，冷冻至-80 ℃，直至进一步使用。

1.4.2 流式细胞仪检测MAIT细胞：根据标准方案使用以下抗体：抗人TCRVα7.2、抗人CD161和抗人CD3进行表面染色。根据文献[9]报道，定义外周血中CD3+CD161+TCRVα7.2+细胞为MAIT细胞。我们通过SSC及FSC设置门，寻找淋巴细胞亚群，随后通过CD3圈门，将CD3阳性细胞进行下一步分析，定义CD161阳性，Vα7.2阳性的细胞为MAIT细胞(见图1)。流式细胞术分析使用FACSCalibur(BD Biosciences)。数据用FlowJo软件(FlowJo LLC、Ashland、OR、USA)进行分析。

注：首先通过SSC及FSC设置门，寻找淋巴细胞亚群(椭圆形所示)(左侧图)，随后通过CD3圈门(中间图)，将CD3阳性细胞进行

1.4.3 观察指标检测：全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、TBIL水平，全自动凝血仪检查INR。上述检测均由我院检验科完成，严格参照仪器使用及试剂说明书操作。MELD评分计算公式：MELD 分值=9.6×ln(Cr mg/dl)+3.8×ln(TBIL mg/dl)+11.2×ln(INR)+6.4[10]。

2 结果

2.1 入组患者的一般情况85例患者中，HBV-ACLF患者年龄较健康对照组大(P<0.05)，CHB患者、LC患者年龄与健康对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；各组患者性别构成比，CHB组、LC组及HBV-ACLF组HBeAg状态、HBV DNA定量差异均无统计学意义(P>0.05)。HBV感染组较健康对照组肝功能指标ALT、AST、TBIL升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；LC组、HBV-ACLF组ALB及PLT与对照组、CHB组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 健康对照组和HBV感染患者的特征Tab 1 Characteristics of healthy controls and HBV infected patients

2.2 HBV感染患者及健康对照组外周血中MAIT细胞的表达水平用流式细胞仪检测外周血中MAIT细胞的百分比，即CD3+CD161+TCRVα7.2+。我们首先检测CHB、LC、HBV-ACLF患者和健康对照者外周血MAIT细胞的百分比。与健康对照组相比，CHB、LC、HBV-ACLF患者的MAIT细胞百分比显著降低。此外，LC患者的MAIT细胞百分比明显低于CHB患者，HBV-ACLF患者的MAIT细胞百分比明显低于LC患者。结果表明，CHB、LC、HBV-ACLF患者外周血MAIT细胞减少，且HBV-ACLF组减少更明显(见表2)。

表2 各组MAIT细胞百分比比较Tab 2 Comparison of MAIT cells in each group

2.3 LC组代偿期与失代偿期外周血MAIT细胞的表达水平对LC代偿期与失代偿期患者外周血MAIT细胞的百分比进行比较，差异有统计学意义(P=0.0132)(见图2)。

2.4 HBV-ACLF患者中MAIT细胞和MELD评分相关性检验及好转组与死亡组外周血MAIT的表达水平绘制MAIT细胞百分比与MELD评分的散点图，发现两者呈负相关(r2=0.6671,P<0.0001,见图3A)。在HBV-ACLF患者中好转组明显高于死亡组，差异有统计学意义(P=0.0003)(见图3B)。

图2 LC代偿期与失代偿期MAIT细胞的比较; 图3 MELD评分与MAIT细胞水平 A：MAIT细胞百分比与MELD的散点图；B：HBV-ACLF好转组与死亡组MAIT的比较Fig 2 Comparison of MAIT cells between compensated and decompensated LC patients; Fig 3 MELD score and MAIT cell expression levels A: scatter plot of MAIT cell ratio versus MELD; B: comparison of MAIT between remission group and death group in HBV-ACLF patients

3 讨论

HBV感染是慢性肝病的主要病因，全世界约有3.5亿人感染慢性HBV[1]，进一步发展为肝硬化和肝衰竭。现今，HBV感染患者在强效低耐药核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗方面已取得一定的成绩，但不能完全阻止病情进展，因为乙肝是免疫介导的疾病，HBV造成的肝损伤及转归与机体细胞免疫密切相关[11]。MAIT是最近描述的先天性T细胞亚群，MAIT细胞构成了人体10%的T细胞和45%的肝脏T细胞，这一现象提示MAIT细胞可能在人类肝脏免疫中发挥更为重要的作用[12]。已有研究证实，ALT、AST、TBIL、ALB及INR是常见的肝功能评价指标，在慢性肝病不同阶段患者外周血中表达有明显差异[13]。在本研究中发现，外周血MAIT细胞水平与上述常规肝功能评价指标一样，在慢性肝病不同阶段存在表达差异。目前许多研究已经观察到MAIT细胞频率与疾病的相关性。在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)及哮喘患者，外周血MAIT细胞比例相比健康对照者降低[14]，MAIT细胞在HIV感染[15]及HIV合并肺结核患者[16]，外周血中严重枯竭。到目前为止，MAIT细胞在人类肝脏疾病中的研究方面非常有限。最近的两项研究[17-18]已经明确表明，在慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C, CHC)患者外周血MAIT细胞百分比减少，外周血MAIT细胞数量的减少可能是由于其在肝脏内的重新分布所致。相比接受索非布韦和利巴韦林治疗患者，接受聚乙二醇化干扰素具有更高的持续病毒学反应率[18]。Spaan等[19]亦指出，HCV感染患者外周血MAIT相比正常人数量明显减少，且经过抗病毒治疗后MAIT细胞频率不能恢复。本研究显示，外周血MAIT百分比在HBV感染患者中低于健康对照组，同时在慢性肝病患者外周血的百分比随肝脏损伤程度的增加而减少，且HBV-ACLF组减少更明显。另外，在LC患者中失代偿期MAIT细胞较代偿期减少。然而有研究报道[20],在HBV患者中，外周血中的MAIT细胞频率未减少，这与本研究和其他各种慢性病毒性和炎症性疾病形成鲜明对比，可能提示了MAIT细胞发挥致病效能的“场所”是在肝脏局部而非全身，当然这需要进一步的实验去证实。

肝衰竭病死率高，预后极差，除肝移植外无有效的治疗方法，因而受到广泛关注。目前并未评价肝衰竭预后的特异性评分或模型。MELD评分在临床上使用较为广泛，且其所选变量具有客观性、稳定性、易于获得等优点[21]。本研究对外周血MAIT细胞百分比与MELD 评分进行相关性分析，结果表明MAIT细胞百分比与MELD评分呈负相关。但血清肌酐测定受非肝病因素的影响，可能导致MELD评分对肝脏疾病严重程度的误判，因此有专家不断对MELD评分进行改进。为了进一步证实MAIT细胞一定程度上反映慢性肝病的严重程度，我们发现在HBV-ACLF患者中好转组明显高于死亡组，提示MAIT细胞水平的降低是判断HBV-ACLF患者预后不良的预测指标。

综上所述，MAIT细胞在HBV感染患者外周血中明显减少，特别是对肝硬化代偿期和肝硬化失代偿期以及肝衰竭好转组和死亡组MAIT细胞水平的变化，提示MAIT细胞可能参与HBV感染慢性化的免疫学发病机制，同时可能在HBV感染的发生发展中发挥重要作用。但研究还存在一些缺陷，如样本量偏少，无HBV感染肝脏织中MAIT细胞的检测及MAIT细胞与HBV DNA滴度水平的相关性，MAIT细胞在HBV感染疾病中确切的免疫学机制及作用尚待进一步明确。