CYP2E1在小鼠酒精性肝纤维化中的作用研究

代新华， 李三强， 宋晓改， 李子昂， 王玉东， 郭 威， 张艺博， 袁旭静， 徐卓硕， 王同园， 刘竞怡

河南科技大学基础医学院肝脏损伤与修复分子医学重点实验室，河南 洛阳 471000

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是长期大量酗酒引起的一系列中毒性肝损伤的总称，早期常诱发脂肪肝，随后发展成酒精性肝炎，若损伤持续加重将进展为酒精性肝纤维化(alcohol liver fibrosi，ALF)甚至肝硬化，最终导致肝癌[1]。ALF是各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉积，分布异常的病理过程，为酒精性肝硬化早期发展阶段[2]。细胞色素P450(cytochromep450,CYP450)氧化酶又称为混合功能氧化酶和单加氧酶，是肝脏代谢最主要的酶系之一，主要定位于肝微粒体，且广泛存在于动物、植物、微生物的各种组织中，是负责大多数临床药物、环境致癌物、外源毒物及内源活性物质生物转化的主要酶系统，与酒精代谢密切相关的主要为细胞色素P4502E1(CYP2E1)[3]。据报道，CYP2E1是CYP450的乙醇诱导形式，它在非乙醇脱氢酶氧化途径中起重要作用，为ALD的主要发病机制[3]。乙醇在CYP450酶体系的CYP2E1的作用下可以转化为乙醛，产生脂质过氧化产物导致肝组织的损伤，同时肝细胞内过量表达的CYP2E1也可以激活肝纤维化的发生[4]。由此可见，CYP2E1不仅能通过模式识别受体激活先天性免疫系统或促进炎症反应，参与机体内胶原合成，而且也具有分子伴侣的功能，其表达的数量在一定程度上可以影响胶原纤维的产量[5]，以上研究表明，其在肝纤维化形成过程中可能起着一定的作用。但目前CYP2E1在ALF形成过程中的作用研究尚未见相关报道。本实验通过Lieber-DeCarli液体饲料建立ALF模型，检测小鼠ALF过程中CYP2E1在肝组织中的表达水平，以探讨CYP2E1在ALF过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康清洁SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体质量(20±2)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.1.2 试剂和饲料：无水乙醇，甲醇；二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；抗CYP2E1单克隆抗体，购自Santa cruz Biotechnology公司；谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒，购自洛阳恒恩生物有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Lieber-DeCarli酒精液体饲料，购自江苏南通特洛菲饲料有限公司。

1.1.3 仪器：008AS全自动生化分析仪，购自日本日立公司；Leica半自动组织切片机(RM2128)，购自德国徕卡有限公司；JY300C电泳仪，购自北京君意东方电泳设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型制备：取健康清洁的雄性C57BL/6J小鼠50只，用普通饲料喂养1周适应环境后，随机分为2组：正常组10只，实验组40只。正常组小鼠每天喂养Lieber-DeCarli TP4030C液体饲料20 ml/只，共8周。实验组小鼠每天喂养Lieber-DeCarli TP4030A液体酒精饲料20 ml/只，共8周，4周后合用5% CCl4-橄榄油溶液腹腔注射2 ml/kg，2次/周，共用时8周诱导小鼠ALF的形成[4]。造模过程中小鼠无死亡。

1.2.2 取材：在0、2、4、6、8周时随机选取4只小鼠进行眼球采血并制备血清；然后颈椎脱臼处死小鼠及时取出肝脏，称重后迅速用PBS冲洗肝脏内残留血液后，剪取肝脏大叶放于福尔马林中固定以用于制备组织蜡块HE染色后观察各时间点小鼠肝脏组织形态结构变化，以判断小鼠肝纤维化模型进展程度。

1.2.3 血清中ALT活性测定：血清ALT活性使用日立自动生化分析仪008AS检测。

1.2.4 蛋白印迹法检测CYP2E1的表达量：称取1 g小鼠肝组织加PBS 10 ml，混合后将研磨器放于冰中进行研磨，离心后取中层清液。然后用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg样品进行SDS-PAGE电泳等实验操作，最后DAB显色，检测阳性信号。显出的蛋白条带通过扫描仪扫描并保存图像，β-actin作为内参。用Gel Pro 4.0软件分析目的蛋白与β-actin蛋白条带灰度值并计算相对表达水平。被检测的目的蛋白相对表达值=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值[6]。

1.2.5 HE染色病理学观察分析：将制成的肝组织蜡块切成4 μm厚度的切片，进行HE染色，显微镜下观察肝组织病理学变化及坏死率。肝细胞坏死率得分统计方法[7]：显微镜100倍视野下观察组织坏死情况，0分：未见坏死；1分：1～2处坏死；2分：2处以上坏死；3分：大片坏死区域。

2 结果

2.1 血清生化指标的分析正常组小鼠0周血清中ALT表达水平为(103±16)U/L，第2周血清中ALT的表达水平为(142±28)U/L，第4周血清中ALT的表达水平为(223±35)U/L，第6周血清中ALT的表达水平为(305±41)U/L，第8周血清中ALT的表达水平为(624±49)U/L。与正常组组相比，实验组在第4周血清中ALT的表达水平均明显升高(P<0.05)，第8周时血清中ALT表达水平达最高峰(P<0.01)。

2.2 蛋白印迹法检测小鼠肝组织CYP2E1表达量Lieber-DeCarli液体酒精饲料喂养后，小鼠肝组织CYP2E1蛋白表达量显著升高，并且在第4周达到最高值(P<0.01)，之后开始下降，第8周与第4周相比降低最显著(P<0.05)(见图1)。

注：与0周正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。图1 蛋白印迹检测CYP2E1蛋白在正常小鼠和酒精诱导后不同时间点的小鼠肝细胞中的表达 A：蛋白印迹代表性图片；B：蛋白印迹定量分析图Fig 1 Western blotting detection of CYP2E1 protein expression in mice hepatocytes at different time points after alcohol induction and normal mice A: representative picture of Western blotting; B: quantitative analysis of Western blotting

2.3 肝组织病理形态观察HE染色：实验组小鼠0周肝组织结构正常，细胞核清晰；第2周肝索开始出现紊乱，肝组织出现轻度的脂肪变性；第4周部分肝细胞胞质内出现大小不一的脂肪空泡；第6周绝大部分肝细胞出现脂肪空泡，并且肝组织内开始出现轻度纤维素样变性；第8周纤维化扩展到门管区周围，呈星芒状放射。正常组小鼠0周肝组织坏死积分为(0.2±0.05)分，第2周小鼠肝组织坏死积分为(0.3±0.06)分，第4周小鼠肝组织坏死积分为(1.1±0.08)分，第6周小鼠肝组织坏死积分为(1.6±0.07)分，第8周小鼠肝组织坏死积分为(2.3±0.09)分。根据统计学分析，与正常小鼠相比，随着造模时间的延长，小鼠肝组织的纤维化程度不断加重(见图2)。

图2 光学显微镜下不同时间点小鼠肝组织HE染色结果(200×) A:0周;B:2周;C:4周;D:6周;E:8周Fig 2 Histological HE staining results of mice at different time points under light microscope (200×) A:0-week;B:2-week; C:4-week; D:6-week; E:8-week

3 讨论

ALF动物模型的建立对研究肝硬化早期的发病机制、诊断和治疗提供重要的思路和方法。ALF是与慢性肝脏损伤相关的瘢痕修复过程[8]，酒精对肝细胞持续性的破坏和损伤，将导致肝脏正常结构发生一系列的变化导致细胞排列紊乱而形成假小叶，并进一步形成酒精性肝硬化，最终甚至发展为肝癌。CYP450是位于滑面内质网上的一组混合功能氧化酶系，是肝脏代谢最主要的酶系之一，目前人类中确定的CYP450同工酶有20多种，CYP2E1是最主要的同工酶，在肝脏中占肝细胞色素酶总量的7%，可参与许多低分子有机化合物及药物在体内的代谢，并能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。CYP2E1可以引起许多毒物物质的代谢盒激活，催化产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)物质，如超氧阴离子基团和过氧化氢等，与氧化应激关系密切[9]。当氧化应激时，体内氧化与抗氧化作用失衡，产生过多ROS，过多的ROS攻击细胞内蛋白质、核酸等生命大分子，是引起众多疾病发生的重要原因，目前有研究证实，多种急、慢性肝病及肝硬化中存在氧化应激，从而加重疾病的病理进程[10]。过多的ROS增强脂质过氧化程度，损伤细胞生物膜功能，并通过协同细胞因子及肝细胞凋亡使肝细胞炎症、坏死及纤维化加重。肝细胞内CYP2E1的过度表达是ROS产生的主要原因，能够促进和加重肝脏的纤维化过程[11]。

经过以上研究发现，小鼠在Lieber-DeCarli液体酒精饲料喂养后，ALT活性在4周后呈明显上升趋势，并随着喂养时间延长逐渐加重，8周损伤最重，致肝纤维化达到最高。CYP2E1蛋白表达水平在第4周最显著，6周开始有所下降。观察HE染色病理学形态变化，可发现肝组织损伤程度逐步加重，第8周达到肝纤维化，同时第8周坏死积分最高。病理学分析，随着喂养时间增加，组织损伤面积也逐渐加大。以上结果表明，随着造模时间的延长，CYP2E1的表达量显著增加，促进了肝脏内的氧化应激反应，产生了大量ROS，促进了肝脏损伤。因此，由以上结果可以看出肝细胞内CYP2E1的表达在ALF形成过程中起着重要的作用，可作为ALF机制研究中的重要分子，并为临床的诊断和治疗提供新的途径和方法。