24个古蔺牛皮茶新品系生化成分及遗传多样性分析

李慧丽，刘双红，杨雪梅，黄嘉诚，文卫旗，陈红旭，高宪云，唐 茜,3*

1. 四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130；2. 四川省名山茶树良种繁育场，四川 雅安 625100；3.精制川茶四川省重点实验室，四川 成都 611130

四川茶树品种资源丰富。李建华等[1]和王小萍等[2]研究发现，四川茶树种质资源具有较高的遗传多样性与育种潜力，其中以荥经枇杷茶、崇州枇杷茶、南江大叶茶、古蔺牛皮茶这 4个地方资源尤为突出。唐建敏等[3-4]、黄福涛等[5]与李慧[6]分别研究了前三者的表型性状和遗传多样性，发现三个种群内变异及资源多样性丰富，遗传背景复杂，并从中培育出南江1号、云顶早、川茶5号等[7-9]茶树新品种。但关于古蔺牛皮茶的研究主要集中在野生牛皮茶群体上，种植品种均为群体种，性状混杂，良莠不齐，推广面积不足67 hm2，因此，开发利用野生牛皮茶资源，选育特异性状新品系迫在眉睫。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以取自四川省名山茶树良种繁育场的 24 个古蔺牛皮茶新品系为研究材料，福鼎大白茶为对照（CK）；所有供试新品系（种）种植于同一块地，树龄均为 5 年，长势良好。

1.2 试验方法

1.2.1 主要生化成分测定

参照陈亮等[10]方法分别在春、夏、秋采摘24个新品系及对照的第1轮新梢一芽二叶制作生化样，测定其茶多酚及儿茶素总量[11]、游离氨基酸总量[12]、咖啡碱[13]、水浸出物[14]；氨基酸组分和儿茶素组分送至中国测试研究生院生物所（成都）测试。

1.2.2 基于SSR标记的遗传多样性

春季采摘24个品系新梢叶片，以锡箔纸包裹，放入液氮速冻，于-80℃ 冰箱中保存；从已发表的文献中选取多态性好、条带清晰、重复性高的10对SSR引物用于本试验[15-17]。样品DNA提取选用植物基因组提取试剂盒（TIANGEN DP305）。扩增结果中清晰条带赋值为1，同一位置无带或难以分辨的弱带赋值为0，建立原始数据矩阵。在同一扩增位点，若有至少一个材料在该扩增位点计数为“1”，则该扩增位点为多态性条带，每条多态性带可视为一个等位基因。

1.2.3 数据统计及分析

数据整理采用Excel 2013，基本数据分析及聚类分析采用SPSS 22.0进行；聚类分析采用离差平方和法（Ward’s method），遗传距离为平均欧氏距离[18]；遗传多样性分析和聚类用 POWERMARKER V3.25 进行，计算供试材料的等位基因数（NA）、等位基因频率（NE）、基因多样性指数（I）、多态信息含量（PIC）等参数。

2 结果与分析

2.1 主要生化成分含量

2.1.1 春夏梢主要生化成分含量

24个古蔺牛皮茶新品系的春、夏梢水浸出物、游离氨基酸等主要生化成分分析结果表明（表1）， 12个新品系生化指标的变异系数在3.63% ～ 27.88%，平均变异系数为11.54%，其中最大的为酚氨比（夏梢），最小的为水浸出物含量（春梢）。各品系间生化成分含量存在较大差异，表现出丰富的遗传多样性。

表1 24个古蔺牛皮茶新品系主要生化成分统计分析Table 1 Statistical analysis of main biochemical components of 24 new strains of Gulin Niupi tea

续表

24个新品系春、夏梢水浸出物含量较高，普遍高于对照（春梢15号、夏梢9号除外）；氨基酸总量方面，春梢中发现三个品系（6号、4号、1号）高于对照10%以上，而夏梢则普遍低于对照，其中5号、9号、14号显著低于对照；茶多酚及儿茶素含量方面，春梢普遍高于对照，茶多酚总量有两个品系高于对照34%以上，儿茶素含量则有三个品系高于对照44%以上；夏梢仅8号、23号的茶多酚含量略低于对照，其余品系茶多酚及儿茶素均高于对照，且茶多酚总量有三个品系高于对照 22%以上，儿茶素含量则有四个品系高于对照 20%以上；咖啡碱方面，春、夏梢咖啡碱含量变幅接近，均在3.10 ～ 4.50，春梢中有5个品系咖啡碱含量高于对照20%以上，而夏梢中高咖啡碱含量特征并不明显，除17号、12号、8号以外均低于对照。

依上分析可知，24个牛皮茶新品系具选育高水浸出物、高EGCG和高咖啡碱等特色品种的潜力。

2.1.2 春夏梢酚氨比

24 个新品系春梢的酚氨比在 6.36 ～ 11.79，变异系数为14.39%；夏梢的酚氨比在9.04 ～ 25.26，变异系数为27.88%。一般认为酚氨比小于8适制绿茶，大于15适制红茶[19]，由此初步鉴定，牛皮茶1号、4号、6号、7号、10号、13号、14号、15号、16号、20号、22号和23号的春梢适制绿茶，牛皮茶9号、11号、14号、17号、18号和19号的夏梢适制红茶。陈正武等根据前人研究和综合实际分析认为将酚氨比小于4.5和大于6.5分别作为判定适制绿茶和适制红茶的标准更为科学[20]，如按照该标准， 则24个牛皮茶新品系中除了牛皮茶15号的春梢（酚氨比6.36±0.75）外，其他资源的春、夏梢均适制红茶。

2.1.3 部分新品系春梢氨基酸组分

从24个新品系中选取春梢氨基酸含量较高（36.18 mg/g ～ 43.19 mg/g）的 6 个新品系进行氨基酸组分测定（表2）。由表可知，牛皮茶6号的21种氨基酸总量最高，其次是牛皮茶4号和1号，分别比对照高21.42%、17.23%和16.11%；氨基酸组分中，天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸和精氨酸是构成茶汤鲜味的重要成分[21]，8个新品系的四者总量为：牛皮茶6号（38.98 mg/g）> 1 号（37.57 mg/g）> 4 号（37.26 mg/g）> 13 号（34.04 mg/g）> 15 号（34.02 mg/g）> 10 号（32.97 mg/g）> CK（31.74 mg/g）。与滋味的相关系数达0.9223[22]的茶氨酸含量高低顺序为牛皮茶6号> 4号> 1号>13号>15号>10号> CK，其中前三者分别比CK高22.17%、16.91%和16.07%。由此可以看出，牛皮茶1号、4号、6号具有加工绿茶滋味鲜爽的物质基础。

表2 部分牛皮茶新品系春梢氨基酸组分分析Table 2 Analysis of amino acid composition in spring shoots of some new strains of Niupi tea

2.1.4 部分新品系春夏梢儿茶素组分

从24个供试新品系中选取春梢茶多酚和儿茶素含量较高的7个新品系进行儿茶素组分测定（表3）。由于牛皮茶5号、12号、17号春、夏梢儿茶素总量均位居前三，因此进一步测定此三者夏梢儿茶素组分。酯型儿茶素含量：牛皮茶 5 号 > 12 号 > 17 号 > 8 号 > 2 号 > 19 号 > 18号，显著高于对照；进一步关注酯型儿茶素的核心成分EGCG，发现其中牛皮茶5号、12号、17号的EGCG含量分别比对照高66.29%、61.03%和56.60%，同时这三个新品系的夏梢含量分别比对照高38.42%、30.16%和40.02%。

表3 部分新品系春夏梢的儿茶素组分分析Table 3 Analysis of catechin components in spring and summer shoots of some new strains of Niupi tea

2.2 遗传多样性

2.2.1 24份材料SSR扩增结果

本试验中24份材料提取的DNA OD260/OD280 比值均在 1.71 ～ 1.87（标准为 1.7 ～ 1.9），DNA浓度均在232.1 ～ 485.2，提取的DNA质量较好。用10对引物对24个古蔺牛皮茶新品系进行SSR-PCR扩增，结果表明，10对SSR引物扩增效果良好，能够得到清晰、易统计的条带。

10个标记共计240个数据点，其中8个位点基因型缺失，可能的原因是PCR扩增失败或存在少数纯和无效的等位基因[23]。10对引物共检测到40个等位基因，平均每对引物检测到等位基因数4个，其中最多的为6个（A18、CS1058）， 最 少 的 为 3个（TM209、A114、TM237、TM052、TM169）；共检测到69个基因型，平均每对引物检测到6.9个基因型，其中最多的为14个（CS1058），最少为4个（A114）。群体内遗传多样性分析结果等位基因频率在0.354～0.870变动，平均值为0.541；期望杂合度（He）在0.130 ～ 0.917浮动，平均值为0.540，多态信息含量（PIC）在0.2272 ～ 0.7527变动，平均值为0.5259；基因多样性指数（H）在0.2372 ～ 0.7821变动，平均值为0.5753（表4），结果表明24份古蔺牛皮茶资源有较高的遗传多样性。

表4 24份牛皮茶资源遗传多样性分析Table 4 Analysis of genetic diversity of the 24 Niupi tea resources

2.2.2 基于SSR标记的聚类分析

依据10对引物的扩增数据，用Power Marker V3.25 计算24个牛皮茶新品系间的Nei遗传距离，结果显示：24个牛皮茶新品系的遗传距离变化范围在0.0800 ～ 1.7984，其中遗传距离最小的是牛皮茶20号和21号，遗传距离最大的是牛皮茶6号和牛皮茶16号。基于各品系间的遗传距离，采用UPGMA法构建聚类图（图2），遗传距离为0.43时，可将24个牛皮茶新品系分为3个类群。类群Ⅰ包括牛皮茶6号和7号，牛皮茶18号单独聚于类群Ⅱ，类群Ⅲ则包括其他21个新品系。

图1 基于SSR分子标记的聚类图Figure 1 Cluster diagram based on SSR molecular markers

3 结论与讨论

3.1 24个牛皮茶新品系生化成分多样性

24个新品系的春、夏梢的游离氨基酸、咖啡碱、水浸出物、茶多酚、儿茶素总量 分 别 为 1.26%±0.04% ～ 4.46%±0.07%、3.11%±0.01% ～ 4.49%±0.03%、35.03%±0.20% ～ 47.81%±0.07%、27.24%±0.18% ～ 37.52%± 0.85%、17.13%±0.89% ～ 27.09%±0.61%，酚氨比在6.36 ～ 25.26。从水浸出物含量来看，有13个新品系春梢的水浸出物含量高于40%，所有品系夏梢全高于40%；表明这些新品系的内含物丰富，所制成茶口感饱满。除此之外，茶多酚和儿茶素总量含量较高，可从中筛选高茶多酚和高儿茶素的新品系。

24个牛皮茶新品系新梢生化成分含量变异较丰富，变异系数在3.63% ～ 27.88%，平均变异系数为11.54%，低于贵州28份茶树种质资源的变异系数（25.45%）和朱明珠等研究的栽培于四川省内的60个茶树品种间的变异系数（30.20%）[24]，且低于130个‘黄山种’自然杂交后代的变异系数（30.5%），推测是因为这些茶树资源来源于不同的祖先和不同的地区，而古蔺牛皮茶群体种生长区域相对集中，分化程度不高。

3.2 24个牛皮茶新品系遗传多样性

遗传多样性可以用于评价物种的遗传潜力。本试验结果表明，24个牛皮茶新品系遗传距离在0.0800 ～ 1.7984，距离最小的为牛皮茶20号和21号，遗传距离最大的为牛皮茶6号和16号，多态信息含量（PIC）平均值为0.5259，基因多样性指数（H）平均值为0.5753，具有较高的遗传多样性，育种潜力大。基于各品系间的遗传距离，可将24个牛皮茶新品系聚为3个类群，类群Ⅰ包括牛皮茶6号和7号，牛皮茶18号单独聚于类群Ⅱ，类群Ⅲ则包括其他21个新品系。除此之外，在SSR标记中聚为一类的新品系生化成分存在一定差异，表明古蔺牛皮茶在自然生长及品种选育过程中受到环境等因素的影响，发生了一定的生理生化变异。

3.3 特异茶树资源的筛选

参考 NY/T 2031—2011 《农作物优异种质资源评价规范 茶树》，以氨基酸总量≥5.0%、茶氨酸≥3.0%、茶多酚总量≥25.0%或≤7.5%、儿茶素类总量≥20.0%为特异性状初步筛选出一批潜在优异种质，其中牛皮茶5号、12号、17号的茶多酚含量较高，春、夏季新梢茶多酚含量都高于33%，儿茶素总量都高于23%，可作为高茶多酚及高儿茶素育种材料，且此三者春梢的EGCG含量均大于150 mg/g，夏梢的EGCG含量分别比对照高38.42%、30.16%和40.02%，可作为高EGCG茶树的育种材料。