新疆北疆地区规模化牛场传染性犊牛腹泻分析

居马别克·夏拉巴依，马晓艳，阿曼古丽·加孜，美热木古丽·巴依待拉提，任 娟，王 文，李 舵

(1.新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，乌鲁木齐 830011)

犊牛腹泻是多种病因引起的一种临床常见疾病，也是导致犊牛死亡的重要原因，可以概括的分为非传染性腹泻和传染性腹泻[1]。非传染性腹泻是由饲养管理不善、营养缺失、饲料调配不合理、饲料中毒、天气变化和长途运输等并非病原感染因素引起的腹泻。传染性腹泻是由病毒(如冠状病毒、轮状病毒)、细菌(如产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌)、寄生虫(如微小隐孢子虫、球虫、线虫)等病原体引起的腹泻[2，3]。该病在犊牛中均为常见疾病，多发生于2月龄内的犊牛，造成1月龄以下犊牛死亡的主要原因之一，严重时可导致70%的犊牛发病，病死率高达50%[4，5]。本文选择新疆北疆地区9个规模化牛场，开展牛传染性犊牛腹泻调查与实验室检测，分析牛场传染性犊牛腹泻发病情况，为临床防治提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年10月31日至2019年6月20日，分别在新疆北疆伊犁州、阿勒泰、塔城每个区选择2～3个规模化养牛场及养殖合作社，以询问或查阅资料方式，填写犊牛传染性腹泻流行病学调查情况表，重点采集新生犊牛有腹泻，粪便呈稀软、水样状态，后期食欲减退，难以站立或出现昏迷等症状的样品，在伊犁州新源县、塔城市、阿勒泰市的3个种牛场、6个规模场采集有上述症状的牛粪便或肛门拭子样品共234份。

1.2 试剂和仪器

消化道ELISA抗原检测试剂盒购自青岛瑞尔生物技术有限公司，生产批号:DIG17K30；营养肉汤培养基、血琼脂等培养基、盖玻片、10种药敏纸片购自乌鲁木齐天和众鑫商贸有限公司；麦康凯琼脂、SS琼脂、沙门氏菌显色培养基、革兰氏染色试剂盒、焦性没食子酸购自乌鲁木齐牧源康兽药器械经销部。

1.3 检测方法

1.3.1 细菌培养

1.3.1.1 增菌培养 无菌抽取采集阿勒泰地区、伊犁州新褐牛场、塔城地区种牛场的犊牛粪便进行增菌培养，无菌取0.5 g接种至9 mL营养肉汤培养基，37℃培养12～24 h；同时挑取粪便，无菌取0.5 g接种至7 mL厌气肝汤培养基，37℃培养24～48 h。24 h后观察是否有菌落产生，如果有，再进行培养、纯化。

1.3.1.2 鉴别培养基培养 继续用接种环无菌取以上两种培养后的增菌液，每份分别划线接种在麦康凯琼脂平板、血琼脂平板和SS琼脂平板，37℃培养24 h。

1.3.1.3 染色镜检 以上三种培养基上生长的典型菌落，用接种环取涂片革兰氏染色后镜检观察。

1.3.1.4 生化试验 按照细菌微量生化反应管(购自杭州微生物试剂有限公司)，对分离到的菌株进行生化指标检测，操作方法与判定结果参照说明书。

1.3.2 药敏试验

采用纸片法对分离到的致病菌进行10种常见抗生素药敏纸片药敏试验。按照K-B法试验要求，每张纸片间距不得少于24 mm，纸片中心距离平皿边缘不少于15 mm。同时做两个平板，进行重复试验，平皿置于37℃培养箱中培养24 h，观察记录结果。

1.3.3 消化道ELISA与球虫检测

采集粪便样品前处理，按照消化道ELISA抗原检测试剂盒说明书操作，该试剂盒可以鉴别检测轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌F5(K99)、微小隐孢子虫，同时采集的样品用漂浮法对样品进行球虫检测。

2 结 果

近1年时间，奔赴新疆北疆三个地区，到伊犁州、塔城地区、阿勒泰地区的3个种畜场、6个规模场共9个场点，采集粪便234份，如下表1显示。

2.1 牛场流行病学调查情况

根据规模化牛场流行病学调查情况分析发现，新疆北疆片区大部分规模牛场及养牛合作社都有犊牛腹泻病例发生，发病率40%左右、死亡率14%左右。在9个牛场的1月龄以内的犊牛腹泻2017年的发病率为45.64%，死亡率为13.67%，2018年的发病率为39.4%，死亡率为13.87%，2019年4个规模化牛场的1月龄以内的犊牛腹泻发病率为32.86%，死亡率为14.14%。

2.2 细菌学检测

2.2.1 细菌培养结果

24 h后观察菌落形态，有138份样品在麦康凯琼脂平板上出现红色或粉红色菌落、有5份出现透明发白小菌落；有123份样品在SS琼脂平板上出现粉红色菌落、有1份出现透明发白小菌落，麦康凯和SS琼脂生长的发白小菌落在后期增菌培养没有得到相应菌株，其余4份无菌落；在血琼脂平板上有15份出现乳白色小菌落β溶血。

2.2.2 镜检

在3种鉴别培养基上挑取接种典型的菌落、将菌落涂片革兰氏染色后镜检观察，大多是短粗状杆菌，从培养基生长特性和镜检结果可确定15株致病性大肠杆菌。如图1-图4。

图1 麦康凯培养基菌落

图2 SS琼脂培养基菌落

图3 致病菌在血琼脂培养基菌落

图4 显微镜观察结果（大肠杆菌）

2.2.3 药敏试验结果

观察药敏片周围有没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性(见表2)，结果分为高敏感、中敏感、耐药。药敏试验结果是大肠杆菌对卡那霉素、磺胺嘧啶、头孢噻呋敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，其它药物都表现为耐药。

表2 药敏试验判断结果

2.3 消化道ELISA抗原检测结果

由于采集样品数量较多，挑取有临床症状非常明显的样品，用消化道ELISA抗原试剂盒进行检测。检测试剂盒通过用腹泻病病原特异性抗体包被96孔微量板，抗体可以捕获粪便中相应的致病病原。

随机选取不同采集点有腹泻症状的234份样品，经ELISA检测，没有检测到冠状病毒抗原，检测到15份轮状病毒抗原，检测到20份微小隐孢子虫抗原，检测到7份大肠杆菌F5抗原。其中伊犁州的种牛场、规模场共47份样品均没有检测到轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌F5、微小隐孢子虫抗原，阿勒泰地区、塔城地区牛场检出不同数量的大肠杆菌F5、微小隐孢子虫抗原和轮状病毒，其中微小隐孢子虫检出的阳性率最高，所有粪便样品检测结果如下表3、图5所示。

图5 北疆规模化牛场消化道ELISA抗原阳性率结果

表3 新疆北疆三个地区粪便样品ELISA检测结果（份）

3 讨论与分析

犊牛传染性腹泻是危害犊牛的常见病之一，有明显的季节性，常发于冬季和春季，还可以导致地方性流行［6，7］。本文流行病学调查发现阿勒泰地区有的规模化牛场夏季也有病例发生(10月份至次年的6月份)。

腹泻犊牛临床症状主要表现为出现白色或者黄色粪便，水样棕色粪便为主，发生的日龄在1～28 d的范围内。导致犊牛腹泻的原因很多，其中大肠杆菌是犊牛腹泻的主要原因之一。大肠杆菌作为肠道菌群的重要组成部分，一般是非致病的，一些特殊血清型的大肠杆菌可导致家畜的腹泻及败血，对家畜具有致病性［8，9］。大肠杆菌经药敏试验，挑选出卡那霉素、磺胺嘧啶、头孢噻呋三种高敏感药物，为临床提供可行性治疗药物［10］。

从上述三个地区发病情况来看，阿勒泰地区犊牛腹泻感染阳性率较塔城、伊犁州高，一方面是临床获取的样本量少，临床判定的疏漏和检测方法的差异，不能整体反映三个地区各个牛场阳性率情况；另一方面是和养殖场饲养管理水平有关系，在饲养条件、圈舍消毒、杀虫、疫病防治等方面都有所改善，犊牛传染性腹泻还需与其他常见病开展鉴别诊断。

4 结 论

本次调查新疆北疆规模化牛场牛传染性腹泻感染情况不容忽视，所有样品经细菌培养检测到大肠杆菌15株，经药敏试验，对磺胺嘧啶、卡那霉素、头孢噻呋高敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，用消化道ELISA抗原试剂盒没有检测到冠状病毒抗原，检测到15份轮状病毒抗原，阳性率为6.41%，20份微小隐孢子虫抗原，阳性率为8.54%，7份大肠杆菌F5抗原，阳性率为2.99%；所有粪便样品均没有检测到球虫，此次调查结果可以为北疆牛场犊牛腹泻提供临床治疗方案。

以上检测结果分析显示：经轮状病毒感染的犊牛样品主要采自阿勒泰地区的规模化养殖场及养殖合作社的一个月龄以内的犊牛都有腹泻症状，大肠杆菌、微小隐孢子虫感染阳性动物临床症状不明显。为系统性地研究牛场犊牛腹泻感染情况，后期加大北疆地区牛场样本量，涵盖引起犊牛腹泻的检测项目如牛病毒性腹泻等，结合饲养管理因素，更能客观的反映牛场犊牛腹泻发生情况，为预防本病发生提供临床数据。