慢性鼻-鼻窦炎伴息肉发病中HIF-1α表达及对Alox5和炎症因子分泌的影响研究

王 嘉，田东倩，魏英粉，杨泽垠，邸 斌

慢性鼻-鼻窦炎是一种鼻腔和鼻腔黏膜持续性的炎症疾病，慢性鼻-鼻窦炎包括两大类，慢性鼻-鼻窦炎伴息肉和慢性鼻-鼻窦炎不伴息肉[1]。两种类型的慢性鼻-鼻窦炎发病机制不同，慢性鼻-鼻窦炎伴息肉的发病机制存在多种说法，总而言之是炎症的过程，与鼻黏膜上皮反应密不可分，比如免疫缺陷、细菌和直菌定植、上皮防御功能降低和天然免疫功能降低等[2]。鼻黏膜上皮重要的功能需要细胞之间紧密连接，紧密连接构建了气道和上皮组织间和气道的物理屏障。鼻黏膜上皮是接受外界环境刺激的屏障，接受外界环境刺激后会导致下游的一系列的炎症反应，这有可能是慢性鼻-鼻窦炎伴息肉发病机制启动的关键因素[3]。但鼻息肉黏膜上皮变化如何引发的鼻息肉目前还未阐明。需要今后更多的研究。乏氧诱导因子1α(HIF-1α)在肿瘤中的相关报道较多，通常在氧浓度为5%时检测到较高蛋白表达水平[4]。5-脂加氧酶(Alox5)属于一种多形核蛋白，是巨噬细胞、单核细胞和肥大细胞中表达的膜结合蛋白，在很多肿瘤中高表达，比如前列腺癌和胰腺癌[5]。但目前关于HIF-1α和Alox5在鼻窦炎中的作用机制尚未见报道，本研究探讨HIF-1α和Alox5在慢性鼻-鼻窦炎伴息肉发病机制中的作用，为临床慢性鼻-鼻窦炎伴息肉的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 病例资料 研究中涉及的组织标本，选取2019年1～10月在医院接受手术治疗的26例慢性鼻-鼻窦炎伴息肉患者的标本为鼻息肉组，选择同期20例鼻窦炎但无鼻息肉患者的窦黏膜组织为无鼻息肉组，本研究经医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。所有患者通过鼻窦CT检查或者鼻内镜检查确诊，其诊断参照《慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南》[6]。鼻息肉组男17例，女9例，平均年龄(44.19±7.36)岁；无鼻息肉组男16例，女4例，平均年龄(43.57±6.94)岁。另选同期接受治疗的20例鼻中隔手术或鼻窦囊肿患者的钩突或中鼻甲黏膜组织作为对照组，男14例，女6例，平均年龄(42.97±7.15)岁。纳入标准：（1）病程已经超过12 w；（2）有鼻塞、黏性或黏性脓肿鼻涕等症状；（3）鼻窦CT检查或者鼻内镜检查确诊；（4）经术后病理证实。排除标准：（1）不符合慢性鼻-鼻窦炎伴息肉诊断的患者；（2）接受过鼻腔减充血剂或糖皮质激素治疗的患者。

1.2 材料和仪器 苏木素染液购于杭州萧山化学试剂厂；Alox5抗体购于上海生工生物工程股份有限公司；HIF-1αshRNA重组质粒和空载（阴性对照）由吉凯公司设计合成；鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、1L-4、1L-13、1L-17A抗体购自美国R&D Systems Inc公司；离心机购于德国Ependorf公司；倒置光学显微镜及成像系统购于德国Leica公司。

1.3 HE染色 把标本组织采用4%的多聚甲醛固定,然后进行酒精脱水，二甲苯透明，在进行石蜡包埋，切成4μm薄片进行HE染色，烤片，脱蜡、苏木素染5 min,伊红染2 min,PBS冲洗3次，观察嗜酸性粒细胞浸润情况。

1.4 免疫组织化学染色 4%的多聚甲醛固定,流水冲洗，4 h固定组织，乙醇浸泡2 h，脱水透明，然后包埋蜡块，切成4μm的薄片，烤片，PBS冲洗，抗原，滴入3%的双氧水溶液，孵育15 min，鼠抗人HIF-1α单克隆抗体按照1∶100稀释，滴加在盒内，在将切片放入湿盒内，室温孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素在切片上，1∶200稀释，冲洗5 min，DAB溶液进行发光，应用苏木素染色，应用盐酸酒精进行分化，不同浓度酒精脱水干燥，透明处理，中性树胶，显微镜下阅片，HIF-1α阳性染色呈现褐色，使用Image pro-P1us6.0软件处理免疫组化图片，IOD为测量的分子的值，计算平均光密度(IOD/area)。

1.5 Western blot检测 取标本迅速放入PBS缓冲液的EP管中，在将组织转移至无菌平皿中反复冲洗，将组织剪切成小块，浸在0.25%的胰蛋白酶中，消化后，吹打至上皮片脱落，弃掉组织块，将细胞悬液胶乳胰蛋白酶和胎牛血清，离心处理后，进行细胞培养。取对数生长期的细胞分为两组，阴性对照组和siHIF-1α组，阴性对照组转染空载质粒，siHIF-1α组HIF-1αshRNA重组质粒。进行蛋白进行提取,采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,转膜,用5%脱脂乳封闭膜,在4℃下,添加一抗Alox5(1:500稀释)孵育过夜,二抗孵育2 h,采用增强化学发光试剂,β-actin作内参,检测Alox5蛋白表达。

1.6 qRT-PCR检测 将鼻息肉标本的提取RNA,反转录cDNA,按照试剂的使用说明进行严格操作,用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平进行检测,1L-4 mRNA上游5'-GTAGGCCATTTGAGAATCCT-3',下游5'-GTTCCA TTGGAACCHAACCGT-3';1L-13 mRNA上游5'-GGA ATGCCACAAGATTCTACT-3',下游5'-GCTTAGGAC CTTGGCCAGTT-3';1L-17A mRNA上游5'-GGTTCG CGCGAATAGCTTACGT-3',下游5'-GATGAATTGGTT AGAGCGCGATG-3';β-actin作为内参,引物序列为上游5'-ACCATCTTHGATCACCTCTATC-3',下游5'-GC GCGCTATAGATACAGTCCATAGC-3',反应条件为95℃,10 min、80℃,30 min、72℃,20 s、65℃,5 min,循环次数为40次,用相对定量2-ΔΔCT计算1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平。同时对阴性对照组和siHIF-1α组中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平进行检测，方法同上。

1.7 统计学方法 应用SPSS 23.0进行数据处理。符合正态分布的定量数据以±s表示，两组间资料比较采用t检验，多组间资料比较采用SNK-q检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻息肉组织病理学观察 HE染色结果显示，与对照组和无鼻息肉组相比，鼻息肉组的嗜酸性粒细胞明显增多（P<0.05）。见图1。

图1 鼻息肉组织HE染色（×100）

2.2 鼻息肉组织中HIF-1α的表达 免疫组织化学染色检测结果显示，对照组、无鼻息肉组和鼻息肉组中HIF-1α的IOD值分别为0.14±0.02、0.21±0.02和0.46±0.03，无鼻息肉组中的HIF-1α的IOD值明显高于对照组（P<0.05），鼻息肉组的HIF-1α的IOD值显著高于无鼻息肉组（P<0.05）。见图2。

图2 鼻息肉组织中HIF-1α的表达（×100）

2.3 炎症因子在鼻息肉组织中的表达 qRT-PCR检测结果显示,无鼻息肉组中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相对表达水平均明显高于对照组（P<0.05），鼻 息 肉 组 中 的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相对表达水平均显著高于无鼻息肉组（P<0.05）。见表1和图3。

表1 炎症因子的表达

2.4 抑制HIF-1α对Alox5表达的影响 Western blot检测结果显示,阴性对照组和siHIF-1α组的蛋白表达分别为3.76±0.07和0.11±0.01，siHIF-1α组中Alox5蛋白表达水平显著低于阴性对照组（P<0.05）。见图4。

图3 炎症因子在鼻息肉组织中的表达

图4 Alox5蛋白表达

2.5 抑制HIF-1α对炎症因子表达的影响qRT-PCR检测结果显示,与阴性对照组相比，siHIF-1α组中1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相对表达水平均显著降低（P<0.05）。见表2和图5。

表2 HIF-1α对炎症因子表达

图5 炎症因子的相对表达

3 讨论

慢性鼻-鼻窦炎伴息肉是一种复杂的异质性疾病，严重的影响了患者的生存质量[7]。中鼻道和鼻窦是鼻息肉发病的主要部位，这可能与中鼻道纤毛分布不均匀，清除微生物的能力差及鼻黏膜上皮细胞生长乏氧等微环境相关[8]。由于此原因，鼻黏膜上皮免疫功能较弱，当微生物入侵该位置时，会加引发鼻黏膜上皮炎症。相关研究表明，HIF-1α能够介导上皮细胞向间充质细胞的转化,而人类鼻黏膜上皮细胞转化为间充质细胞是鼻息肉组织重塑的主要原因[9]。所以抑制HIF-1α可能成为治疗慢性鼻-鼻窦炎伴息肉的新靶点。Alox5含有非血红素铁的双加氧酶，也会炎症介质的起始酶。相关研究表明，Alox5与很多疾病的发病相关，比如心血管疾病、变应性鼻炎以及肿瘤等[10]。但Alox5的表达至今未在慢性鼻-鼻窦炎伴息肉中出现过相关报道，本研究主要探讨慢性鼻-鼻窦炎伴息肉发病中HIF-1α的表达及对Alox5和炎症因子分泌的影响，为临床在慢性鼻-鼻窦炎伴息肉靶向治疗方面提供可靠依据。

嗜酸性粒细胞的激活和募集是嗜酸性粒细胞炎症的主要特征，嗜酸性粒细胞炎症与辅助的T细胞和HIF-1α表达关系密切[11]。本研究通过HE染色结果显示，与对照组和无鼻息肉组相比，鼻息肉组的嗜酸性粒细胞明显增多。为了验证HIF-1α在鼻息肉组织中的表达，采用免疫组织化学染色检测，结果显示，无鼻息肉组中的HIF-1α的IOD值明显高于对照组，鼻息肉组的HIF-1α的IOD值显著高于无鼻息肉组。从而说明鼻息肉的患者中HIF-1α表达明显升高，相关研究报道，鼻息肉组织与健康黏膜组织相比，HIF-1α的表达显著增高[12]。鼻黏膜上皮是抵抗鼻腔微环境的第一道防线，当受到外界刺激时，通过合成和分泌相关细胞因子启动下游的免疫反应[13]。有研究发现，HIF-1α在鼻息肉的血管内的血管细胞中也呈现高表达[14]。

研究表明，慢性鼻-鼻窦炎伴息肉是一种T细胞型细胞炎症为主的疾病，表现为相关的细胞因子升高，以IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-1b和IFN-γ分泌为主[15]。本实验仅研究了鼻息肉组中的1L-4、1L-13、1L-17A的表达，通过qRT-PCR检测结果显示，无鼻息肉组中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相对表达水平明显高于对照组，鼻息肉组中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相对表达水平显著高于无鼻息肉组。不仅说明了鼻息肉的患者中1L-4、1L-13和1L-17A的表达明显升高，而且也说明1L-4、1L-13和1L-17A参与了鼻息肉炎症的变化。有研究证实，鼻息肉上皮细胞中HIF-1α与IL-17A分泌在低氧刺激时具有明显相关性，推测抑制1L-17A炎症反应，就抑制了淋巴血管生成[16]。进而采用沉默siHIF-1α表达， 验证HIF-1α与1L-4、1L-13和1L-17A的相关性，结果发现，沉默HIF-1α的表达，能够有效抑制1L-4、1L-13和1L-17A的水平，从而抑制了炎症反应。同时也通过Western blot检测证明发现，沉默HIF-1α的表达，也能够降低Alox5蛋白表达。相关研究表明，在甲状腺癌中诱导Alox5可有诱导炎症的表达，从而促进肿瘤的侵袭，反之，抑制Alox5的表达，可以抑制炎症反应[17]。

综上所述，慢性鼻-鼻窦炎伴息肉中HIF-1α呈现高表达，沉默HIF-1α，能够降低Alox5的表达和炎症因子分泌，其机制可能通过抑制Alox5来降低炎症因子的分泌。HIF-1α和Alox5可能成为慢性鼻-鼻窦炎伴息肉发病机制的重要靶点。