套膜海葵总蛋白的提取和酶解条件优化及其杀虫活性

袁 琳， 符金星， 刘雪菲丹， 高炳淼

(海南医学院 药学院/热带转化医学教育部重点实验室， 海南 海口 571199)

0 引言

【研究意义】海葵(Aiptasiapallida)又名海菊花、海淀根，属刺细胞动物门珊瑚虫纲六放珊瑚亚纲海葵目，是原始的后生海洋动物，全球已记录海葵目1 100余种，分属于50科约400属[1]。中国的海葵品种约占世界的1/10，广泛分布在温热带和热带海域，且明显呈现“南海最多，黄海次之，东海最少”趋势[1-2]。【前人研究进展】《中华本草》和《中国药用动物志》均记载：海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用于治疗脱肛、痔疮和蛲虫病等[3]。《青岛中草药手册》记载：治蛲虫病，将海葵1块塞入肛门，每晚1次，连用1周。现代药理学研究表明，海葵多肽毒素具有杀虫、抗肿瘤、降压、抗菌、镇痛和神经抑制的作用[4-7]。海葵主要通过刺细胞分泌毒液捕食鱼、贝类、桡足类、甲壳类动物及蠕虫[8]。【研究切入点】传统的海葵多肽毒素分离步骤费时、费力、得率低，很难获取足够的量用于大规模生产和产业化应用[9-10]。近年来，广泛应用酶解法制备海洋生物活性肽，该法制备的海洋活性多肽既能补充机体营养成分，又具有抗氧化、降血压、抗肿瘤及抗凝血等活性[11-16]。目前，针对其抗虫活性的研究鲜有报道[17]。【拟解决的关键问题】以套膜海葵为材料，采用裂解液法提取海葵总蛋白；以酶解得率为指标，采用单因素试验研究不同蛋白酶对海葵总蛋白酶解的影响，结合正交试验筛选确定最优酶解条件；同时，利用昆虫注射法进行多肽抗虫活性分析，以期为拓展和开发海葵酶解多肽的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 套膜 海葵采集于儋州附近海域，用去离子水冲洗干净，置于实验室-80℃冷冻储存备用。

1.1.2 试剂 胃蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白酶，湖北远成药业有限公司；中性蛋白酶，上海一研生物科技有限公司；碱性蛋白酶，太原发凯化工有限公司；蛋白Marker，上海伟进生物科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒，广州赛国生物科技有限公司；蛋白上样缓冲液，天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器设备 台式低速大容量离心机，济南博鑫生物科技有限公司；高速冷冻离心机，日立仪器有限公司；恒温水浴锅，上海启前电子科技有限公司；数字型pH计，杭州科晓化工仪器设备有限公司；紫外可见分光光度计，上海鼎科科学仪器有限公司；超声波细胞破碎仪，苏州索尼克超声科技有限公司；酶标仪，美国Bio Rad科技公司。

1.2 方法

1.2.1 海葵总蛋白的提取及含量测定

1) 总蛋白的提取。海葵以去离子水洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，浸泡于异丙醇中去脂，每4 h更换1次异丙醇，连换3次，再用纯水将异丙醇冲洗干净[17]。置于通风橱中沥干，分装标记，于-20℃保存备用。取适当样品于小烧杯中，加入混合后的RIPA(放射免疫沉淀法)裂解液(强)500 μL与PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)5 μL，静置30 min后超声破碎至溶液浑浊。4℃、10 000 r/min离心5 min，收集上清液得到粗品，真空冷冻干燥得干粉，置于-20℃保存备用。

2) 海葵总蛋白及其多肽含量测定与SDS-PAGE分析。总蛋白和酶解多肽的含量均采用BCA蛋白测定试剂盒测定。按说明书配方制胶，取冻干蛋白10 μL与2×Loading Buffer缓冲液10 μL混匀，置水浴锅中95℃煮沸5 min，取Marker 10 μL上样，电泳。经考马斯亮蓝染色和脱色观察，用凝胶成像系统观察记录电泳结果。

1.2.2 最佳水解酶的筛选 根据蛋白酶种类试验设4个处理，依次为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。取去脂后的海葵总蛋白2 g加纯水10 mL，分别加入相应的蛋白酶，在各自最适条件下进行酶解(表1)[18]。酶解完全后煮沸灭活15 min。滤液在12 000 r/min离心10 min，连续离心2次，收集上清液用0.45 μm滤膜过滤，调节pH为7并将产物冷冻干燥，置于-20℃冰箱保存备用。经SDS-PAGE电泳与BCA法同时分析酶解效果，根据酶解得率确定最佳水解蛋白酶。

表1 4种蛋白酶的最适酶解条件

酶解得率=多肽含量/总蛋白含量×100%

1.2.3 海葵总蛋白酶解条件优化 在前期预试验基础上综合考虑各因素，选取pH、温度、时间和最佳水解蛋白酶(碱性蛋白酶)添加量为独立变量，酶解得率为因变量，采用4因素3水平L9(34)进行正交试验(表2)，优化海葵总蛋白的最佳水解条件[19]。

表2 海葵总蛋白酶解条件优化L9(34)正交试验的因素与水平

1.2.4 海葵酶解多肽的制备与杀虫活性测定

1) 制备海葵酶解多肽。采用最佳酶解条件酶解海葵总蛋白制备海葵多肽。酶解产物经10 kDa超滤管离心，收集滤液获得小于10 kDa的海葵酶解多肽，BCA蛋白测定试剂盒测定含量。

2) 杀虫活性测定。按浓度0.50 μg/mg、0.75 μg/mg和1.00 μg/mg分别用0.7%盐水将海葵多肽溶解制备成海葵多肽溶液备用。试验设5个处理，其中，采用液体微量注射器分别注射5 μL前述浓度的海葵多肽溶液至黄粉虫幼虫的下腹部，剂量约为180 mg/头;以注射等体积的0.7%盐水(阴性对照)和不注射(空白)为对照，每组处理10只黄粉虫，3次重复。注射后12 h内观察黄粉虫的行为变化和死亡率，以评估海葵酶解多肽的杀虫效果[20]。

1.3 数据统计与分析

数据采用SPSS 20进行统计分析，P<0.01则认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 海葵总蛋白的提取及含量

SDS-PAGE电泳结果(图1)表明，通过裂解液法提取到海葵总蛋白，其分子量主要分布在31.0～43.0 kDa，部分位于22.0 kDa及97.4 kDa，14.4 kDa及以下分布蛋白较少。因此，提取到的套膜海葵具有丰富的低分子量和高分子量蛋白质，可以酶解获得大量的多肽，便于发掘具有抗虫活性的酶解多肽。BCA蛋白测定试剂盒测定结果表明，从20 g套膜海葵中提取海葵总蛋白160 mg，蛋白浓度为0.5 mg/mL。

注：M，低分子量蛋白Marker；1、2和3表示海葵蛋白样品条带。

2.2 不同蛋白酶处理海葵总蛋白的酶解效果

采用4种不同蛋白酶酶解海葵总蛋白，其酶解得率为碱性蛋白酶(6.41%)>中性蛋白酶(5.23%)>胃蛋白酶(2.97%)>胰蛋白酶(1.53%)，其中，碱性蛋白酶的酶解得率最高，为最佳蛋白酶；其次是中性蛋白酶，胃蛋白酶和胰蛋白酶相对较低。从海葵总蛋白酶解后的多肽电泳结果(图2)看出，碱性蛋白酶的酶解效果最好。结合酶解得率和电泳结果可以得出，碱性蛋白酶是海葵总蛋白的最佳蛋白酶。

注：M，低分子量蛋白Marker；1、2、3和4分别表示胃蛋白酶酶解样品、胰蛋白酶酶解样品、中性蛋白酶酶解样品和碱性蛋白酶酶解样品。

2.3 海葵总蛋白的酶解条件优化

从表3看出，9个处理以A1B3C3D3的酶解得率最高，为9.145%；其次是A1B2C2D2、A2B1C2D3和A2B2C3D1，分别为8.395%、8.375%和8.325%。极差分析表明，各因素对海葵总蛋白酶解得率的影响为pH>温度>加酶量>时间。pH的影响最大，其中，pH 8>pH 9>pH10；温度的影响其次，其中，55℃>60℃>50℃；加酶量的影响为4 000 U/g>1 000 U/g>2 000 U/g；时间的影响为2 h>6 h>4 h。综上看出，碱性蛋白酶的最佳酶解条件组合为A1B3C3D3，即pH 8、加酶量4 000 U/g、温度60℃、时间6 h。在此条件下，酶解产物得率为9.145%。

表3 正交试验海葵总蛋白的酶解得率

2.4 海葵酶解多肽的杀虫活性

从图3看出，空白和阴性对照组中黄粉虫的死亡率均为0，0.5 μg/mg(低剂量组)的黄粉虫死亡率为10%，0.75 μg/mg(中剂量组)的黄粉虫死亡率为50%，1.0 μg/mg(高剂量组)的黄粉虫死亡率为90%。其中，0.5 μg/mg海葵酶解多肽处理的黄粉虫死亡率与空白对照和阴性对照间均存在显著差异，与0.75 μg/mg和1.0 μg/mg存在极显著差异；0.75 μg/mg与1.0 μg/mg处理间也存在极显著差异，具有统计学意义，且存在剂量依赖性。说明，昆虫注射法可用于评价海葵酶解多肽的杀虫活性。

注：**、***和****分别表示P<0.01、P<0.001和P<0.000 1。

3 讨论

海葵是我国南海丰富的海洋生物资源，但目前尚未进行深入开发和利用。主要原因在于：一方面是海葵中多肽毒素含量少，传统分离和提取无法获取足够的量；另一方面是海葵多肽毒素毒性强烈，无法克服其存在的副作用。因此，海葵的规模化和产业化研究受到严重制约，而寻找新的途径开发海葵资源就显得尤为重要。当前，制备海洋多肽的常用方法：1) 传统分离手段，直接从生物体或组织中分离提取多肽[21-22]；2) 针对已知多肽序列，采用化学固相合成法制备多肽[23-24]；3) 采用各种蛋白酶酶解大分子蛋白获得多肽。对比以上3种制备海洋多肽的方法，其中酶解法制备海洋多肽具有产率高、安全性高及反应条件温和等优点[11，25-26]。

目前，国内关于海葵的杀虫活性研究和酶解法制备具有生物活性肽的研究较少。刘少华等[4]从舟山黄海葵粗毒中筛选出7种多肽，其具有强杀虫活性但对哺乳动物低活性，即对脊尾白虾及黄粉虫幼虫具有强且快速的麻痹、致死活性，对小鼠毒性虽较弱但仍会引起小鼠出现瘫软症状。吴宗泽等[17]采用碱性蛋白酶酶解绿侧花海葵蛋白，并利用超滤和色谱分离技术制备具有抗肿瘤活性的多肽。该研究采用裂解液法从套膜海葵中提取到海葵总蛋白，结果发现，裂解液法提取海葵蛋白操作简单、经SDS-PAGE电泳后条带多且清晰分明，对后续试验无影响。蛋白酶筛选和优化试验表明，海葵的最佳蛋白水解酶为碱性蛋白酶，且时间和pH等因素与吴宗泽等[17]研究一致。但碱性蛋白酶添加量和酶解温度均较吴宗泽等[17]的高，原因可能是在一定范围内酶解得率与酶解温度和加酶量呈剂量依赖关系。杀虫活性试验结果表明，经蛋白酶酶解后获得的海葵酶解多肽具有杀虫活性，注射剂量为1.0 μg/mg时黄粉虫的致死率达90%。

4 结论

研究结果表明，采用裂解液法从套膜海葵中提取获得的海葵总蛋白分子量主要为31.0～43.0 kDa，部分位于22.0 kDa及97.4 kDa；20 g套膜海葵可提取海葵总蛋白160 mg，蛋白浓度为0.5 mg/mL；海葵总蛋白的最佳水解酶为碱性蛋白酶；海葵总蛋白的最优酶解条件为pH 8、碱性蛋白酶4 000 U/g、温度60°C、酶解6 h，在此条件下酶解得率为9.145%；昆虫注射海葵酶解多肽1.0 μg/mg时死亡率达90%。因此，采用酶解法制备海葵多肽简单可行，不受海葵毒液量的限制，同样具有杀虫活性且比海葵毒液对哺乳动物的安全性更高。

研究获得适合海葵总蛋白酶解的最佳蛋白酶以及最优酶解条件，利用超滤技术得到海葵酶解肽并分析其杀虫活性，可为深入开发海葵资源提供参考。