基于氯化血红素模拟酶活性的荧光分析法检测牛奶中胆固醇含量

王令臣，洪诚毅，黄志勇

（集美大学食品与生物工程学院 福建厦门361021）

胆固醇（Cholesterol）又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲衍生物[1]。胆固醇作为人体一种重要的脂质，是构成细胞膜的重要部分，可维持细胞膜的稳定并调节细胞膜的流动性[2]。人体自身可以合成胆固醇，也可从食物中摄取胆固醇，然而过度摄入胆固醇会引起诸如心肌缺血、冠状动脉粥样硬化和冠心病等疾病[3]。人体每日胆固醇的摄入量不应该超过200 mg/dL[4]。目前胆固醇的检测方法主要有：高效液相色谱法（HPLC）[5]、电化学法[6]和比色法[7-8]。HPLC 法需要大型的仪器、设备，而且依赖专业技术人员操作。比色法通常采用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）进行显色，然而其在空气中易被氧化且难溶于水，导致检测限高、稳定性差。研究一种简便、快速、准确性强的胆固醇检测方法很有必要。

氯化血红素作为过氧化物模拟酶，相较于辣根过氧化物酶（HRP）获取成本低、易储存、不易变性，应用广泛[9]。酪胺是过氧化物酶的理想供氢荧光底物[10-11]，在波长426 nm 处有最大荧光峰，由于其反应快速、灵敏，因此常被用于过氧化氢等物质的检测[12]。本试验采用酪胺作为供氢底物检测荧光强度，可以降低检测限，提高检测灵敏度，检测原理如图1所示。胆固醇被胆固醇氧化酶氧化产生过氧化氢，过氧化氢在氯化血红素催化下氧化酪胺产生荧光。通过测定反应体系在波长426 nm处的荧光强度，可测定样品中的胆固醇含量。

图1 试验原理示意图Fig.1 Schematic illustration of the detection method principle

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

牛奶、低脂牛奶、脱脂牛奶和酸奶购于当地超市；胆固醇（≥99%）、胆固醇酶（Cholesterol oxidase，ChOx），西格玛试剂公司；葡萄糖、尿素、抗坏血酸、氯化钙、氯化铁、无水乙醇（分析纯级），西陇试剂公司；二甲亚砜（分析纯级），国药集团；氯化血红素，上海麦克林生化科技有限公司；曲拉通，阿拉丁试剂公司；乙腈（色谱纯级）、甲醇（色谱纯级），德国默克公司。

超纯水机（电阻率18.2 MΩ·cm），德国赛多利斯；离心机，于凯达湘仪；MS7-H550-Pro 数控加热磁力搅拌器，美国赛洛捷克仪器公司；荧光分光光度计，美国Perkins Elmer 仪器有限公司；HPLC，美国安捷伦有限公司。

1.2 检测方法

用无水乙醇配制1 mmol/L 的胆固醇储备液，再用含有0.4%曲拉通的PBS 缓冲液稀释胆固醇，稀释液在60℃下加热10 min，冷却至室温，加入胆固醇氧化酶，混匀并置于37℃摇床中孵育30 min。加入酪胺和氯化血红素溶液，室温下孵育15 min 后测量波长426 nm 处的荧光强度，激发波长320 nm。

1.3 条件优化

试验对胆固醇氧化酶含量（0，4，12，20，28，40 mU/mL）、氯化血红素浓度（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mmol/L）、酪胺浓度（0，0.1，0.35，0.7，1.05，1.25 mmol/L）、酪胺氧化时间（0，5，15，20，30 min）进行优化，获得最佳的反应条件。

1.4 选择性试验

选择葡萄糖、尿素、抗坏血酸、氯化钙和氯化铁作为干扰组分，将胆固醇氧化酶与胆固醇及干扰物混匀，在37℃摇床中孵育30 min，加入酪胺（0.7 mmol/L）和氯化血红素（0.1 μmol/L），室温下孵育15 min，测量波长426 nm 处的荧光强度，激发波长320 nm。

1.5 线性范围与检出限

分别配制浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，5，10，15 μmol/L 的标准胆固醇溶液，按照检测方法分析荧光强度与胆固醇浓度的线性关系，得到线性方程和相关系数，根据3σ/k（σ为9 次检测胆固醇标准偏差，k 为斜率）确定该方法的检测限。

1.6 牛奶样品处理

取5 mL 牛奶样品于100 mL 圆底烧瓶中，加入30 mL 无水乙醇和10 mL 600 mg/mL 的氢氧化钾溶液，混匀，100℃下回流1 h，皂化结束后用流水冷却至室温。定量转移全部皂化液于100 mL 离心管中，加入30 mL 正己烷与10 mL 超纯水，充分震荡，静置分层。取上清液，氮气吹干，残渣用1 mL 含有0.4%曲拉通的PBS 缓冲液溶解。

1.7 加标回收与HPLC 验证

对市售的纯牛奶、低脂牛奶、脱脂牛奶和酸奶进行加标回收试验，设置100 μmol/L 和200 μmol/L 2 个加标水平，按照样品处理方法处理并测定胆固醇含量。每种样品平行测定3 份。计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

使用HPLC 测定方法[13]检测样品中的胆固醇含量，HPLC 操作条件：C18 色谱柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈，流速1 mL/min，检测波长205 nm。

2 结果

2.1 检测条件的优化

由图2可知，当ChOx、氯化血红素和酪胺浓度分别为28 mU/mL，0.1 mmol/L 和0.7 mmol/L时，检测信号最强。此外，随着酪胺氧化时间的延长，荧光强度逐渐增大，15 min 后，荧光强度基本不变，故酪胺氧化时间选取15 min。

图2 胆固醇氧化酶（a）、氯化血红素（b）、酪胺浓度（c）和酪胺氧化时间（d）对荧光强度的影响Fig.2 Effects of ChOx（a），hemin（b），tyramine concentrations（c）and tyramine oxidation time（d）on fluorescence intensity

2.3 方法的线性范围与检测限

图3a 表明，在0.1～16 μmol/L 浓度范围内，随着胆固醇浓度的增加，荧光强度也逐渐增加；在0.1～2 μmol/L 浓度范围内，荧光强度与胆固醇浓度呈良好的线性关系，线性方程为F=34.85C+165.3（R2=0.992）。用3σ/k 计算检测限为0.08 μmol/L。表1为几种胆固醇检测方法的比较，本试验具有较低的检测限。

图3 不同浓度胆固醇对应的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence emission spectra of different concentrations of cholesterol

表1 不同胆固醇检测方法的比较Table 1 Comparison for cholesterol detection method

2.4 胆固醇检测方法的选择性

图4表明，胆固醇的检测荧光信号强度明显高于其它5 种干扰物质，说明葡萄糖、尿素、抗坏血酸、钙与铁对胆固醇的检测基本无干扰。因此，本试验方法具有良好的选择性。

图4 胆固醇检测方法的选择性Fig.4 Specificity of the assay for the detection of cholesterol

2.5 市售牛奶样品中胆固醇的检测

将检测方法用于不同牛奶样品中胆固醇的检测。如表3所示，胆固醇的回收率在98.7%～112.7%之间，RSD 为1.0%～3.1%，表明该方法有较好的准确性和精密度。采用HPLC 验证方法的准确性，其结果与荧光检测法结果一致（表4），说明本方法准确、可靠。

3 结论与讨论

表2 胆固醇加标回收试验结果（n=3）Table 2 Results of cholesterol recovery test（n=3）

表3 本试验方法与HPLC 法检测结果的对比（n=3）Table 3 Comparison of detection results between this method and HPLC（n=3）

本试验利用氯化血红素作为过氧化物酶的模拟酶，结合胆固醇氧化酶氧化胆固醇产生过氧化氢的性质，建立了一种基于酪胺荧光变化来检测牛奶中胆固醇含量的方法。通过对反应条件进行优化，试验最佳条件为：胆固醇氧化酶含量为28 mU/mL，氯化血红素浓度为0.1 mmol/L，酪胺浓度为0.7 mmol/L，反应时间为15 min。方法的线性范围为0.1～2 μmol/L，线性方程为F=34.85C+165.3（R2=0.992），检测限为0.08 μmol/L。与几种胆固醇的检测方法相比，本方法具有较低的检测限。将本方法应用到牛奶样品中胆固醇的加标检测，回收率98.7%～112.7%，相对标准偏差≤3.1%，说明本方法具有方便、快速、灵敏、特异性强等优点。