复合发酵剂和香辛料对发酵香肠中N-亚硝胺形成的抑制作用

孙学颖，辛晓琦，刘建林，靳 烨，赵丽华

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018）

发酵香肠是指将去除筋膜的动物肉和脂肪绞碎，添加发酵剂、食盐、香辛料等充分搅拌均匀后灌肠，在自然或人工控制条件下，经发酵制成的具有独特风味、可长期贮藏的发酵肉制品[1]。为了赋予香肠更好的色泽、风味及安全性，通常加入硝酸盐或亚硝酸盐进行腌制。硝酸盐可被还原生成亚硝酸盐，而亚硝酸盐可与二级胺经亚硝基化作用，在体内、体外结合生成亚硝胺[2-3]。目前已证实90%N-亚硝基化合物中可诱导不同器官的肿瘤，严重危害健康[4]。长时间小剂量摄入或者一次高剂量摄入亚硝胺类化合物，均可导致癌症的发生，而且它们诱发的肿瘤可以在任何器官，甚至还能通过胎盘和乳汁引起后代癌变[5]。由于原料肉中富含蛋白质和氨基酸，经蛋白酶和氨基酸脱羧酶作用会生成某些胺类物质，香肠在发酵阶段温度升高导致酶活升高，促进胺类物质的生成，而胺类物质为N-亚硝胺形成的底物[6]，因此在发酵香肠制作过程中控制N-亚硝胺含量对于食品安全和品质控制具有十分重要的意义。

目前亚硝胺的控制研究主要集中在阻断N-亚硝胺的形成、促进N-亚硝胺的分解、减少N-亚硝胺的前体物质3 个方面，主要从原料及加工工艺[7]、发酵剂[8]、外源添加物（香辛料及植物提取物等）进行控制[8-10]。其中，接种优良发酵剂和添加香辛料是目前控制发酵肉制品中亚硝胺最常见、最有效的方法。研究表明，接种发酵剂可有效控制亚硝酸盐、生物胺和亚硝胺含量[11]。接种发酵剂菌株可降低亚硝酸盐残留量[12]，如商业发酵剂PROMIX5 和LC 单菌均能显著降低9 种N-亚硝胺总量[13]。研究表明，香辛料提取物对风干肠中亚硝酸盐和亚硝胺具有明显的清除和阻断作用，由强到弱的依次是桂皮、丁香和花椒[14]，这是由于香辛料提取物通过氧化-还原反应降低亚硝酸盐积累，从而阻断亚硝胺的形成。发酵剂种类和不同香辛料均会对肉制品中N-亚硝胺的抑制效果产生很大的影响，目前发酵剂和香辛料共同作用的研究报道较少。

在本试验腌制过程中分别添加香辛料、接种复合发酵剂或将二者同时添加，经发酵、干燥、成熟制得发酵剂组、沙葱+孜然组和沙葱+孜然+发酵剂组4 组发酵香肠产品，通过对产品的pH 值、水分活度、微生物指标、亚硝酸盐、生物胺和N-亚硝胺等相关指标的测定，同时与对照组相比，分析复合发酵剂和香辛料对发酵羊肉香肠安全品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏尼特羊后腿肉、羊尾脂肪采于内蒙古乌拉特中旗。复合发酵剂配比为V木糖葡萄球菌∶V肉葡萄球菌∶V37X-3∶V37X-6=1∶1∶2∶1[15]；木糖葡萄球菌（编号CICC 22943），中国工业微生物菌种保藏中心；肉葡萄球菌（编号CIMT.044），广东省微生物菌种保藏中心；戊糖片球菌（37X-3）和植物乳杆菌（37X-6），内蒙古农业大学“肉品科学与技术”团队提供。孜然粉，购于呼和浩特市华联超市；沙葱，购于鄂尔多斯市，于60℃条件下烘干，粉碎后过40 目筛得沙葱粉，备用。

N-亚硝胺标品、生物胺标品，美国Sigma 公司；乙腈、丙酮、乙酸铵、冰乙酸、亚硝酸钠、甲醇、正己烷、丹磺酰氯，呼和浩特市达音商贸有限公司。乙腈、丙酮、乙酸铵、冰乙酸、甲醇为色谱纯级，其余为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Agilent1260vwd 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；UV-1800 型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；日本EYELA MGS-2200C 氮吹仪，上海旦鼎国际贸易有限公司；ZWYR-240 台式真彩触摸屏摇床，南京依贝仪器设备有限公司；DSH-300A 回旋式水域恒温振荡器，上海雅荣生化设备仪器有限公司；ZXMP-A1430 恒温恒湿培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KDC-14DHR 离心机，Eppendorf 中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵羊肉香肠的加工方法 各试验组发酵香肠的工艺流程如下：

原料肉→将瘦肉绞碎、肥肉切丁→搅拌均匀（加入辅料）→腌制→灌肠→发酵→干燥→成熟（成品）。具体步骤是：

1）腌制 各组分别称取搅碎的羊后腿肉1 600 g 和大小为1 cm×1 cm×1 cm 左右的羊尾脂肪400 g，对照组加入蔗糖8 g，葡萄糖8 g，食盐40 g，硝酸钠112 mg，亚硝酸钠112 mg。发酵剂组按107CFU/g 接种复合发酵剂，沙葱+孜然组添加沙葱32 g、孜然48 g，沙葱+孜然+发酵剂组接种复合发酵剂并添加沙葱32 g、孜然48 g。搅拌均匀后在4℃条件下腌制12 h；

2）灌肠 将每组肠馅分别灌入直径为26 mm 的胶原蛋白肠衣中，制成10 cm 长的香肠；

3）发酵 将制好的香肠转移到恒温恒湿箱中，于温度30℃、相对湿度95%的条件下发酵48 h；

4）干燥 在温度14℃、相对湿度85%条件下干燥72 h；

5）成熟 在温度13℃、相对湿度75%条件下成熟72 h。

1.3.2 试验设计本试验设计分为4 组发酵香肠；对照组：不接种发酵剂、不添加沙葱和孜然；发酵剂组：只接种复合发酵剂；沙葱+孜然组：只加入沙葱、孜然；沙葱+孜然+发酵剂组：接种复合发酵剂、添加沙葱和孜然。

分别于腌制（0 d）、发酵（2 d）、干燥（5 d）、成熟（8 d）阶段结束时取样，测定pH 值、水分活度、微生物指标、亚硝酸盐、生物胺和N-亚硝胺。

1.3.3 pH 值、水分活度的测定pH 值参照GB 5009.237-2016《食品pH 值的测定》[16]测定；水分活度参照GB 5009.238-2016《食品水分活度的测定》[17]测定。

1.3.4 亚硝酸盐含量的测定 按照GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》测定发酵羊肉香肠中亚硝酸盐的含量[18]。

1.3.5 生物胺含量的测定 按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》测定羊肉发酵香肠中生物胺含量[19]。采用高效液相色谱仪联合C18 柱子（柱长250 mm，柱内径4.6 mm，柱填料粒径5 μm）和紫外检测器检测生物胺的含量。样品进样量20 μL，流动相流速0.8 mL/min，柱温35℃，紫外检测波长254 nm。梯度洗脱程序：流动相A、B起始质量分数分别为60%，40%，保持22 min；第22 分钟流动相A、B 分别为85%，15%，保持3 min；第25 分钟流动相A 升至100%，保持7 min；第32.01 分钟流动相A、B 质量分数为60%，40%，保持至第37 分钟。色流动相A 为90%乙腈-10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸铵溶液），流动相B 为10%乙腈-90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸铵溶液）。

1.3.6 亚硝胺含量的测定 参照的温演庆等[20]的方法略作改进。采用高效液相色谱仪联合C18 柱子（柱长250 mm，柱内径4.6 mm，柱填料粒径5 μm）和紫外检测器检测。样品进样量10 μL，流动相流速0.8 mL/min，柱温40℃，紫外检测波长230 nm。梯度洗脱程序：流动相A、B 起始质量分数分别为90%，10%，保持5 min；第5 分钟流动相A、B分别为80%，20%，保持15 min；第20 分钟流动相A 降至30%，保持10 min；第30 分钟流动相A 降至20%，保持10 min；第40 分钟流动相A、B 质量分数为90%，10%，保持至第45 分钟。流动相A 为缓冲液溶液，流动相B 为甲醇。

1.4 数据统计分析

采用软件SPSS 18.0 进行数据统计和显著性差异分析，每个试验重复3 次。统计学显著性分析P＜0.05 表示差异性显著。采用Origin 2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 复合发酵剂和香辛料对发酵羊肉香肠pH 值的影响

由图1可看出，腌制结束后0 d，各组pH 值均在5.5 左右，无显著差异（P＞0.05）。发酵结束后2 d，各组的pH 值降为最低值（P＜0.05）。其中发酵剂组pH 值降为4.69，沙葱+孜然+发酵剂组pH 值最低为4.43。这可能是由于在发酵过程中，温度升高，发酵剂迅速生长为香肠中的优势菌，增大了发酵速度，发酵剂代谢大量乳酸促使发酵香肠pH值下降。干燥阶段（5 d）各组pH 值均升高且差异显著（P＜0.05）。发酵剂组pH 值由4.64 升到4.84，沙葱+孜然+发酵剂组pH 值由4.43 升到4.60。可能是沙葱和孜然中的有效成分促进微生物及肉组织中的酶发挥作用，使发酵香肠中产生了一些碱性的含氮物质[21]。成熟后（8 d）各组pH 值均有适当回升，可能是由于碳水化合物被消耗，乳酸菌利用含氮化合物以及蛋白酶发生降解，形成蛋白质使碱性物质浓度增加所引起[18]。总体来说，沙葱+孜然+发酵剂组发酵香肠加工过程中pH 值显著降低（P＜0.05），可以一定程度上抑制腐败菌的生长，保证产品的安全性[22]。

图1 加工过程中复合发酵剂和香辛料处理组的发酵香肠pH 值的变化Fig.1 Changes of pH value on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.2 复合发酵剂和香辛料对发酵羊肉香肠水分活度的影响

低水分活度可提高发酵香肠货架期和食用安全性。由图2可知，随着加工时间的变化，各组的aw值逐渐降低。腌制结束后0 d，各组发酵香肠的水分活度值在0.92 左右（P＜0.05）。发酵结束后2 d，发酵剂组的aw值为0.909，显著低于其它组（P＜0.05）。在干燥结束后5 d，各组的aw值明显下降（P＜0.05），且aw值均低于0.9。香肠成熟后8 d，各组的aw值明显下降至0.8 左右（P＜0.05），可有效抑制腐败微生物的生长。发酵剂组和沙葱+孜然组的水分活度均低于对照组，水分活度的降低与pH值有关，pH 值的降低会使蛋白质发生凝胶化，香肠表面的水分会分散到空气中，导致水分活度值降低[23]。

图2 加工过程中复合发酵剂和香辛料处理组发酵香肠水分活度的变化Fig.2 Changes of water activity on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.3 复合发酵剂和香辛料对发酵羊肉香肠亚硝酸盐的影响

由图3可知，在香肠加工阶段，随着时间的延长，亚硝酸盐含量逐渐降低，这与贾仁勇等[24]研究结果一致。在腌制结束后0 d，对照组和试验组的亚硝酸盐的含量差异显著（P＜0.05）。发酵结束后2 d，沙葱+孜然+发酵剂组亚硝酸盐的含量显著下降（P＜0.05）。在成熟结束8 d，试验组亚硝酸盐含量均低于对照组（P＜0.05），其中，沙葱+孜然+发酵剂组为5.66 mg/kg，此时的aw值较低，微生物的作用小，亚硝酸盐可能转变成硝酸盐，使亚硝酸盐含量降低。以上说明孜然、沙葱和发酵剂的共同作用使亚硝酸盐减少效果最好。在试验中添加的植物乳杆菌和戊糖片球菌起到关键作用，随着pH 值的降低，亚硝酸盐残留量也降低，与梁鹏等[25]的研究结果一致。整个试验过程中，各组的亚硝酸盐残留量低于国家规定30 mg/kg，亚硝酸盐没有超标，保障了香肠的安全问题[26]。

图3 加工过程中复合发酵剂和香辛料处理组发酵香肠亚硝酸盐含量的变化Fig.3 Changes in the contents of nitrite on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.4 复合发酵剂和香辛料对发酵香肠加工过程中生物胺含量的影响

由图4a所示，酪胺含量呈先升后降的趋势，添加复合发酵剂和香辛料可以抑制酪胺含量。在发酵结束2 d，各组的酪胺含量上升的速率明显，说明这是具有酪氨酸脱羧酶活性菌株的活跃时期，可能是发酵阶段环境温度高，使具有脱羧酶的微生物活性增强，其中对照组酪胺含量显著高于试验组（P＜0.05）。干燥阶段各组酪胺含量开始下降。至香肠成熟后8 d，发酵剂组、沙葱+孜然+发酵剂组发酵香肠酪胺含量显著低于对照组（P＜0.05），其中发酵剂组的含量最低为9.746 mg/kg。前期研究表明，复合发酵剂菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳杆菌（37X-6）具有降解酪胺的能力，减少发酵香肠中酪胺含量的积累[27]。与本研究类似，许女等[28]研究发现，接种植物乳杆菌到鱼肉香肠中，可显著降低生物胺的含量。有报道，香辛料对腐败微生物具有一定的抑菌作用，而发酵肉制品中的生物胺一般由腐败微生物（如肠杆菌、假单胞杆菌等）产生。沙葱中存在着多糖、黄酮类化合物、生物碱和香精油等多种生物活性物质，对微生物的生长具有很强的抑制作用[29]。马梦梅等[30]研究表明孜然中特征成分有孜然精油、蛋白、多酚、膳食纤维等，其中孜然精油、多酚均有抑菌作用。李伟等[31]研究表明孜然精油成分主要有枯茗醛和2-蒈烯-10-醛、3-蒈烯-10-醛、γ-松油烯等，均具有较强的抑菌能力。因此，将发酵剂和香辛料添加到发酵肉制品中可有效降低酪胺的含量。

组胺是发酵肉制品常见的8 种生物胺中毒性最大的生物胺。由图4b所示，组胺的含量总体上呈先上升后下降的趋势。发酵阶段（2 d）是组胺迅速积累的时期，干燥阶段（5 d）各组的组胺含量显著下降，发酵剂组的组胺含量最低为3.376 mg/kg。香肠成熟后（8 d），各组的组胺含量持续下降，发酵剂组未检出组胺。前期研究表明，复合发酵剂菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳杆菌（37X-6）具有降解组胺的能力，减少发酵香肠中组胺含量的积累[27]。沙葱+孜然+发酵剂组的组胺含量为3.289 mg/kg，显著低于其它组（P＜0.05），说明添加发酵剂和香辛料降低发酵香肠中组胺含量的作用明显。

腐胺和尸胺是发酵肉制品中最常见的生物胺。由图4c 和图4d 可看出，发酵阶段（2 d）是腐胺和尸胺迅速积累的时期。香肠成熟后（8 d），各组腐胺、尸胺含量显著下降（P＜0.05），发酵剂组腐胺、尸胺含量最低，显著低于对照组（P＜0.05），且发酵剂组色胺未检出，而香辛料对腐胺、尸胺没有抑制作用。与本研究相类似，王德宝等[32]将复配发酵剂菌株接种到香肠中，可有效抑制尸胺、苯乙胺的形成。

发酵阶段（2 d）是色胺（图4e）和苯乙胺（图4f）含量极具积累的阶段，干燥阶段（5 d）色胺含量缓慢增加，苯乙胺含量缓慢下降。添加发酵剂和香辛料对抑制苯乙胺和色胺的形成有明显作用，成熟阶段（8 d），各试验组苯乙胺和色胺的含量均显著低于对照组（P＜0.05）。其中发酵剂组对苯乙胺、色胺抑制作用最明显。精胺和亚精胺为肉中所固有胺类物质，且在香肠加工过程含量变化小[33]，未对其加以分析。

图4 加工过程中复合发酵剂和香辛料处理组发酵香肠6 种生物胺含量的变化Fig.4 Changes in the contents of eight BAs on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.5 复合发酵剂和香辛料对发酵香肠加工过程中亚硝胺含量的影响

目前NDMA 为肉制品中最主要的N-亚硝胺[34]。国级标准仅限量肉制品中NDMA 含量为3 μg/kg[35]。4 组发酵红肠中7 种N-亚硝胺总量随加工时间的变化如图5a所示。本试验中对照组成品中NDMA 含量6.125 μg/kg，超过国家标准，而试验组未超过限量标准。NDMA 的含量总体呈先升高后降低的趋势，添加复合发酵剂和香辛料均可抑制NDMA 含量。腌制结束（0 d），对照组显著高于试验组（P＜0.05），沙葱+孜然+发酵剂组含量最低为2.698 μg/kg。干燥结束（5 d），NDMA 含量上升，而试验组NDMA 含量均显著低于对照组（P＜0.05）。成熟结束（8d），各试验组NDMA 含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中发酵剂组NDMA 含量最低为1.284 μg/kg、沙葱+孜然+发酵剂组NDMA 含量为1.605 μg/kg、沙葱+孜然组NDMA 含量为1.656 μg/kg，说明添加发酵剂和香辛料可不同程度地减少NDMA 的含量，且发酵剂效果最好，这可能是由于发酵剂菌株产生可降解NDMA 的酶系[36]，或者菌体对NDMA 有吸附作用[37]。

对于除NDMA 以外的6 种N-亚硝胺，目前无国际限量标准。对于NDEA（图5d），发酵后（2 d），发酵剂组NDEA 的最低含量为0.929 μg/kg，沙葱+孜然+发酵剂组、沙葱+孜然组、对照组含量依次为1.143，1.197，2.414 μg/kg。可能是在发酵阶段，pH 值降到最低，乳酸菌对亚硝胺起到降解作用。香肠成熟后（8 d），对照组含量升高，试验组NDEA 含量显著低于对照组（P＜0.05），且沙葱+孜然+发酵剂组的最低含量为0.362 μg/kg，说明添加沙葱+孜然和发酵剂的共同作用可减少NDEA 的含量。由图5b 可知，成熟后各组NMOR 的含量降低，试验组NMOR 含量均低于对照组，其中沙葱+孜然+发酵剂组NMOR 最低含量为1.160 μg/kg，可见发酵剂和香辛料共同作用下效果最好。由图5e 可知，成熟后（8 d），试验组NPIP 含量均显著低于对照组（P＜0.05），说明发酵剂组和香辛料均可减少NPIP 的含量。而对于NPYR（图5c）、NDPA（图5f）和NDBA（图5g），在不同加工阶段各组的含量并未呈较一致的规律性。

图5 加工过程中复合发酵剂和香辛料不同处理组发酵香肠7 种亚硝胺含量的变化Fig.5 Changes in the contents of seven nitrosamine on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

3 结论

添加复合发酵剂和香辛料可有效抑制发酵香肠加工过程中4 种N-亚硝胺（NDMA、NDEA、NMOR 和NPIP）以及6 种生物胺（酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）的积累，且沙葱+孜然+发酵剂组效果最好。发酵剂和香辛料共同作用还可促进发酵香肠pH 值和水分活度的降低，亚硝酸盐含量降至5.66 mg/kg。将复合发酵剂和香辛料应用到发酵香肠的生产中，既可抑制发酵香肠中生物胺的积累又可改善发酵香肠品质。