烟熏对鲟鱼肉特性及脂质组成的影响

陈 康，张卓潍，沈 清，戴志远*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连116034 4 新昌县鲟鳇生物科技有限公司 浙江绍兴312521）

鲟鱼是一种大型淡水鱼，是鱼类最原始的类群之一，在黑龙江、松花江等地均有分布，经济价值和科研价值较高[1]。我国鲟鱼养殖业发展迅速，鱼子酱产量增长迅速，而鲟鱼肉作为鱼子酱的加工副产物未得到充分利用[2]。养殖鲟鱼肉脂肪含量较高，对加工工艺要求较高。相关研究发现，鲟鱼肉脂肪氧化迅速是鱼腥味产生的主要因素[3-4]。目前国内鲟鱼肉加工产品较少，主要为烟熏鲟鱼肉[5]、鲟鱼松[6]、鲟鱼片[7]、鲟鱼肠[8]等。

脂质是水产品中重要的活性物质，包括甘油三酯、磷脂和固醇等，并且水产品中ω-3 多不饱和脂肪酸含量较高[9-10]。海洋动物脂质中，磷脂的不饱和程度较高，并富含DHA 和EPA 等多不饱和脂肪酸，具有重要的研究价值[11]。磷脂广泛存在于生物细胞内，是细胞膜的重要组成部分，具有多种生理功能[12-13]。脂肪酸不饱和程度增高使得其稳定性降低，而鱼肉富含多不饱和脂肪酸，在加工过程中容易造成脂肪酸氧化，引起营养损失。烟熏技术是一种传统的肉制品保存技术，通过高温及熏烟引起食品脱水从而延长保存期限，并赋予食品特殊的颜色和风味[14]。虽然烟熏工艺可以抑制鲟鱼脂肪酸酸败，但是烟熏的高温也会加速鱼肉脂肪酸氧化形成酸类和酮类物质[15-16]。目前，烟熏鲟鱼的研究主要针对菌落总数、脂肪酸氧化及风味物质变化，暂无针对鲟鱼不同部位及鱼肉脂质体的研究。本文采用亲水作用色谱-质谱联用（Hydrophilic interaction chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）技术和主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法，系统研究鲟鱼肉不同部位在烟熏过程中磷脂成分的变化，以期为烟熏鲟鱼肉工艺优化提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

史氏鲟鳇（史氏鲟♀×达氏鳇♂），新昌县鲟鳇生物科技有限公司。3 种磷脂标准品：磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholines，PC）PC-14∶0/14∶0、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）PE-15∶0/15∶0 和磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）PS-14∶0/14∶0（纯度均大于99.9%），美国Avanti Polar Lipids 公司；乙腈（色谱纯级），德国Merck 公司；氯仿、甲醇等试剂，国药集团。

1.2 仪器与设备

4000 Q-TRAP 三重四级杆质谱仪（配有ESI离子源），美国Applied Biosystems 公司；HPLC 高效液相色谱系统，美国Waters 公司；7890B 气相色谱仪，美国Agilent 公司；TMS-PRO 物性分析仪，美国FTC 公司；Fresco-21G 台式离心机，美国Thermo Fisher 公司；Millipore 超纯水系统，美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 鲟鱼烟熏工艺 取冷冻鲟鱼肉于常温解冻并去皮去骨，流水洗净表面黏液，切成1 cm 厚的鲟鱼片，然后清洗沥干，放入调味料中浸渍30 min。取出鲟鱼肉放入烟熏炉中热风干燥，干燥温度定为55℃，干燥时间设定为30 min。熏材采用苹果木，烟熏温度60℃，烟熏时间40 min。

1.3.2 质构测定方法采用TPA 方法[17]测定样品破断强度和凹陷深度，采用P/50 不锈钢球形探头，直径5 mm，穿刺速度60 mm/min，每组样品重复测量5 次。

1.3.3 脂肪酸组成测定参照Bligh 等[18]方法。取4 g 鱼肉完全绞碎，加入12 mL 脂质提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1）均质3 min，再超声提取20 min，低温离心后（10℃，8 500 r/min，15 min），取下层氮吹得粗油脂。在提取油脂中加入5 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，于65℃水浴20 min，振摇至油滴消失并冷却。加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，于65℃水浴5 min，超声提取10 min 后加入2 mL 正己烷，振摇后用2 mL 饱和NaCl 淋洗上层，取上层用无水硫酸钠脱水，过滤待测。采用峰面积归一化法分析各脂肪酸组分的相对含量。每组样品重复测试3 次。

气相色谱条件[19]：HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.15 μm）；升温程序：初温50℃保持2 min 后以4℃/min 升至250℃，保持15 min；进样口温度250℃，分流比40∶1，进样量1 μL，载气流速0.65 mL/min。

1.3.4 磷脂提取方法 采用改进后的Bligh-Dyer法提取鲟鱼肉磷脂[20]。准确称取鲟鱼肉样品1.0 g，加入12.0 mL 脂质提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），振荡后于20℃水浴超声提取20 min。加入6 mL 超纯水，于8 000 r/min，10℃离心10 min，收集有机相。水相中加入6.0 L 氯仿重复提取2 次，合并3次提取液并氮气吹干。干燥后加入1 mL 磷脂溶解液（V氯仿∶V甲醇=1∶1）复溶，用0.2 μm 有机滤膜过滤后用于质谱检测。

1.3.5 液相色谱条件 色谱柱：Cosmosil HILIC色谱柱（4.6 mm×250 mm，2.5 μm）；流动相A：水相（20 mmol/L 甲酸铵，18 mmol/L 甲酸，超纯水溶解）；流动相B：有机相（18 mmol/L 甲酸，乙腈溶解）。梯度洗脱程序[21]：0 min（95% B），3 min（95%B），18 min（70% B），23 min（50% B），28 min（50%B），29 min（95% B），32 min（95% B）。流量：0.6 mL/min；进样量：2 μL。

1.3.6 质谱条件电喷雾离子源ESI 负离子模式；离子源电压（IS）-4 500 V；毛细管温度500℃；气帘气（CUR）172.368 kPa；雾化气（GS1）165.474 kPa；辅助气（GS2）206.843 kPa；扫描范围m/z 600～1 000[22]。

1.4 数据处理

采用Analyst Software v1.6.3 软件进行数据采集，用Lipid View 1.2 进行磷脂分子种鉴定，用Excel 2013 和SPSS 22 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 烟熏过程对鲟鱼肉质构的影响

烟熏加工工艺通过热量传递及烟熏材料吸附在鱼肉表面的方式，使鱼肉组织失去一部分水分，从而延长鱼肉制品的保质期。从图1可以看出，鲟鱼背部组织硬度高于腹部组织，这可能是由于鱼体背部脂肪含量较少，蛋白质含量相对较高，肌肉蛋白纤维组织结构具有更强的耐压能力[23-24]。经过烟熏工艺加工后，烟熏鲟鱼腹部组织硬度高于背部组织，这可能是由于烟熏过程中，烟熏颗粒附着在鱼肉组织表面，同热力学共同作用使鱼肉组织脱水[25]。烟熏过程中，鲟鱼肉组织脂肪渗出，引起鲟鱼肉脂肪含量下降，而鲟鱼腹部具有更多的水分与脂肪，烟熏后肌肉蛋白纤维含量增高，使得鲟鱼腹部具有更高的硬度。烟熏过程对鲟鱼肉质构的影响如表1所示，烟熏后的鲟鱼肉具有更高的回复性、内聚性、弹性、胶黏性、咀嚼性，而弹性则在不同部位具有强度差异。

图1 烟熏工艺对鲟鱼肉硬度的影响Fig.1 The effect of smoking technology on hardness of sturgeon

表1 烟熏工艺对鲟鱼肉结构的影响Table 1 The effect of smoking technology on the structure of sturgeon

2.2 脂肪酸组成分析

本研究共检测到鲟鱼肉中脂肪酸15 种，其中饱和脂肪酸（SFA）5 种，单不饱和脂肪酸（MUFA）4种，多不饱和脂肪酸（PUFA）6 种；烟熏鲟鱼肉中共检测到脂肪酸13 种，其中饱和脂肪酸4 种，单不饱和脂肪酸4 种，多不饱和脂肪酸5 种，鲟鱼烟熏过程脂肪酸组成的变化如表2所示。由表2可知，鲟鱼腹部不饱和脂肪酸相对含量高于背部组织，其中腹部EPA 和DHA 相对含量也显著高于背部。本次试验结果与早期研究基本一致，说明鲟鱼肉不饱和脂肪酸含量高，具有较高的营养价值和保健功能[26-27]。烟熏后，鲟鱼组织的多不饱和脂肪酸含量显著下降，分别下降了5.31%（腹部）和3.75%（背部）。烟熏后鲟鱼组织腹部和背部组织的不饱和脂肪酸相对含量差异不显著，并且EPA 和DHA 相对含量相近。相关研究表明[28]，不饱和脂肪酸具有热不稳定性，随着不饱和程度的提高稳定性降低，更易被氧化。因此，鲟鱼腹部组织由于脂肪酸不饱和程度高，在受热烟熏过程中更易氧化，所以在加工鲟鱼时，鲟鱼背部组织可以采用热熏处理，而腹部组织更适宜采用冷熏等温度较低、较为温和的加工方式。

表2 鲟鱼肉及烟熏鲟鱼肉脂肪酸组成分析Table 2 Analysis of fatty acid composition of smoked and raw sturgeon meat

（续表2）

2.3 鲟鱼肉与烟熏鲟鱼肉的脂质组学分析

2.3.1 磷脂标准品分析将3 种磷脂标品以1∶1∶1 混合，配制混合标准溶液，测试保留时间。磷脂由亲水性头部与疏水性脂肪酸尾部组成，可以通过洗脱液梯度洗脱进行不同磷脂分子种分离，并通过提取图谱上标准品的保留时间进行磷脂分子种鉴定[29]。由图2可以看出，本试验方法可有效分离3 类磷脂分子种。在负离子模式中，PE 和PS 因去质子化而以[M-H]-为特征离子，PC 由于流动相中甲酸存在而以[M+CH3COO]-为特征离子。由图2可知，PC、PE 和PS 的出峰时间分别为11.64，12.49 min 和16.58 min。

图2 磷脂标准品HILIC-MS 图Fig.2 HILIC-MS of phospholipid standard

2.3.2 脂质组学分析 由鲟鱼肉与烟熏鲟鱼肉的HILIC-MS 图（图3）可知，本试验的液相方法可以有效地分离磷脂种，通过对比标准品出峰时间，选取相近出峰位置进行分子提取，可以得到各磷脂分子种（图4）[30]。通过Lipid View 软件定性分析及相对含量测定，共鉴定出鲟鱼肉中PC 分子20 种、PE 分子24 种、PS 分子12 种（表3）。由表可知，鲟鱼肉背部、鲟鱼肉腹部、烟熏鲟鱼肉背部和烟熏鲟鱼肉腹部4 种鲟鱼肉样品中，含量最高的PC 分子都是C34：1，分别达到16.60%，14.93%，18.70%，20.70%；除烟熏鲟鱼肉腹部样品外（PE C36：0，18.93%），含量最高的PE 分子是C38：1，分别为14.50%，14.22%，15.60%；除烟熏鲟鱼肉腹部样品外（PS C44：9，19.02%），含量最高的PS 分子是C40：6，分别为23.32%，24.31%，17.07%，这表明鲟鱼肉中PS 分子不饱和脂肪酸含量较高。当磷脂分子不饱和度≥5 时，其中一条脂肪酸可能含有EPA 或DHA 链，因此本试验提取磷脂中不饱和度≥5 的分子种作为研究磷脂分子种高不饱和脂肪酸相对含量的参考。试验结果表明，鲟鱼肉的磷脂组成中高不饱和脂肪酸相对含量较高。鲟鱼肉烟熏前、后腹部多不饱和脂肪酸含量高于背部，这是由于鱼肉背部蛋白质含量较高，而腹部含有较高的油脂。烟熏后，鲟鱼肉背部不饱和脂肪酸磷脂含量分别降低了3.40%（PC）、1.87%（PE）和15.81%（PS），其中PS（C44：9）分子含量下降显著，达到9.11%。鲟鱼肉腹部不饱和脂肪酸磷脂组成分别降低了5.01%（PC）、12.89%（PE）和10.90%（PS），其中PS（C40：6）分子含量下降12.52%。试验结果表明，用鲟鱼肉腹部磷脂在烟熏过程中不饱和脂肪酸氧化程度更高，这与脂肪酸分析结果一致。

图3 鲟鱼肉HILIC-MS 图Fig.3 HILIC-MS of raw sturgeon meat

图4 鲟鱼肉PC（a）、PE（b）、PS（c）质谱图Fig.4 Mass spectrometry of PC（a），PE（b）and PS（c）of sturgeon meat

表3 鲟鱼肉及烟熏鲟鱼肉磷脂分子种组成分析Table 3 Analysis of molecular species composition of phospholipid in smoked and raw sturgeon meat

（续表3）

2.4 主成分分析

通过SIMCA 14.1.0 软件对48 组样品中的磷脂成分进行主成分分析，得到第1 主成分（贡献率为50.6%）和第2 主成分（贡献率为16.55%），2 种组分的总贡献率为67.15%，因此，PCA 方法可以有效反映不同鲟鱼样品的特征磷脂。

烟熏鲟鱼样品的PCA 评分散点图如图5所示，图中散点可分为左右2 个集群，左面集群为鲟鱼肉，右面集群为烟熏鲟鱼肉，烟熏后鲟鱼肉磷脂组成发生显著改变。进一步分析鲟鱼肉集群发现鲟鱼肉腹部和背部磷脂可以分为A，B 2 个集群，并且2 个集群距离较远，说明鲟鱼肉腹部和背部磷脂组成具有较大差异，可以作为区分鲟鱼不同部位的指标，有待进一步研究[31]。烟熏鲟鱼肉集群可分为a，b 2 个集群，2 个集群距离较近，说明经过烟熏后鲟鱼肉中磷脂组成差异性减少。同时烟熏后鲟鱼肉的磷脂样品离散程度增加，说明烟熏对鲟鱼肉磷脂影响具有一定的随机性，不同的磷脂在烟熏的过程中变化程度也不同。

图5 鲟鱼和烟熏鲟鱼样品主成分分析散点图Fig.5 Principal component analysis of smoked and raw sturgeon samples

3 结论

通过分析烟熏鲟鱼肉质构，发现经过烟熏工艺后鲟鱼腹部组织比背部组织具有较高的质构差异，其中硬度和弹性差异显著。在烟熏过程中，鲟鱼肉多不饱和脂肪酸会发生氧化损失，其中腹部组织下降较多，达5.31%。采用脂质组学分析方法对烟熏鲟鱼肉进行分析，发现烟熏工艺会引起磷脂脂肪酸链不饱和程度下降，其中对PS 分子不饱和度影响最显著。通过主成分分析，发现磷脂可以作为区分鲟鱼肉腹部和背部的定性指标。研究发现，烟熏工艺会显著影响鲟鱼肉磷脂组成并使腹部与背部磷脂组成差异性减少。同时，烟熏对鲟鱼肉的影响具有一定的随机性。本研究发现热熏工艺会引起鲟鱼肉脂肪酸氧化，不饱和脂肪酸含量显著下降，不适于加工脂肪酸含量较高的腹部组织，可考虑采用液熏等冷熏工艺替代。本研究为优化不同部位烟熏鲟鱼肉产品的加工工艺提供数据参考及理论依据。