非变性Ⅱ型胶原蛋白对老年db/db小鼠运动机能的改善作用

樊 蕊，郝云涛，康佳伟，胡佳妮，徐美虹，李 勇

（北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系 北京100191）

随着年龄增加，中老年人肌骨系统会出现退行性病变，包括，骨质疏松、骨关节炎、肌肉减少症等，表现为骨质丢失、关节软骨磨损、骨微结构破坏，肌肉减少，最终导致相应功能退化[1-3]。骨质疏松和骨折被认为是与增龄相关的2 型糖尿病并发症[4]，并且60 岁以上患者肌肉减少症的患病率高于血糖正常人群1～2 倍[5]。肌骨系统退行性病变不仅对运动系统影响巨大，还损坏了糖尿病老年患者的运动机能，显著增加了跌倒事件和骨折的发生率。肌骨系统的增龄性病变还可影响其它系统的机能，严重影响糖尿病老年患者的生存状态和生活质量。因此，关注糖尿病患者肌骨系统的退行性疾病，提升其运动机能，对提升患者生活质量具有深远意义。

软骨的主要组成物质之一是胶原蛋白，其构成中90%以上为Ⅱ型胶原蛋白。Ⅱ型胶原蛋白起到维持软骨组织和结构的完整性，刺激软骨细胞生长分化，提升关节性能，促进骨形成的作用[6-8]。

目前，传统的Ⅱ型胶原蛋白生产主要经过氯仿脱脂、盐酸胍去多糖、蛋白酶解等步骤[9]。然而，在制备过程中经过高温酶解，易发生部分变性，使其结构发生变化，进而影响其作用与功能。本研究采用国内首例研发的非变性Ⅱ型胶原蛋白，研究其对老年糖尿病小鼠运动能力的改善作用，具有重大的现实意义。本研究率先采用终生喂养自发2 型糖尿病小鼠——db/db 小鼠作为模型动物，旨在对老年2 型糖尿病患者运动能力的提升提供膳食营养依据，改善患者的生存状态和生活质量。

1 材料与方法

1.1 实验动物与受试物

雄性db/db 小鼠【10 周龄，体重（25 ±2）g】，与之周龄匹配的同窝出生的非糖尿病雄性小鼠（db/m），由北京大学医学部实验动物中心提供【实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0010】。屏障环境动物房【实验动物使用许可证号：SYXK（京）2016-0041】，SPF 级动物房，饲养环境温度21～23℃，湿度50%～60%。以美国营养学会（AIN-93G）动物饲料作为基础饲料，所有动物自由饮水进食。待db/db 小鼠正常喂养至50 周龄，将45 只小鼠【空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L，体重（73 ±2）g】分为3 组：模型对照组（饮用无菌蒸馏水）、阳性对照组【饮用硫酸软骨素（180 mg/kg bw）复配氨基葡萄糖（225 mg/kg bw）溶液】、UCⅡ干预组【饮用非变性II 型胶原蛋白（6 mg/kg bw）配制的溶液】。正常对照组（n=15）为同周龄db/m 小鼠（正常饮用无菌蒸馏水），青年对照组（n=15）为正常喂养至25周龄的雄性db/db 小鼠（正常饮用无菌蒸馏水）。干预16 周，在干预第12 周进行运动能力评估。干预结束后，眼眶取血，脱颈椎处死，无菌快速剥离组织器官，待测。

非变性Ⅱ型胶原蛋白（UCⅡ）、硫酸软骨素、复配氨基葡萄糖，北京盛美诺生物技术有限公司。

1.2 仪器

CatWalk XT 10.6 动物步态采集分析系统，荷兰Noldus 公司。

1.3 方法

1.3.1 动物一般状态观察及体格指标测定 每天观察小鼠状态（毛发光泽、精神状态和活动情况），每周记录小鼠摄食量、饮水量、体重。

1.3.2 腓肠肌指数 小鼠处死后，快速剥离腓肠肌，称重，计算腓肠肌指数。

腓肠肌指数（%）=腓肠肌重（g）/体重（kg）×100

1.3.3 爬网能力评价 将小鼠放置在垂直置于地面的金属网（150 cm×50 cm）顶端，记录小鼠在金属网上的停留时间。

1.3.4 步态情况评价 为了让小鼠适应通道环境，首先对小鼠进行行为学训练，训练期间不做数据记录。将小鼠放置于跑道起点端，让其自由探索，从起点端跑至重点端，认为成功完成一次训练。若小鼠迟迟未跑完全程，或者原地不动，可以给予小鼠一定的刺激，或者在终点的暗盒中放置食物，诱导其跑至终点。每只小鼠每天训练3 次，连续训练1 周。正式测试中，测试期间如果小鼠出现踌躇、往回跑、停止等情况，则需要重新再跑。合格的跑动中须包含7～8 个连续步数。每只小鼠的测试至少要有3 次有效跑动结果，之后用软件CatWalk XT Version 10.6 分析，取各个指标均值用于最后的统计分析。

1.4 统计学分析

所有结果以平均数±标准差表示，数据统计采用SPSS 20.0 软件。采用ANOVA 对组间进行分析。采用LSD 分析各组之间差异。采用Pearson 分析表征参数之间的相关性。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 老年db/db 小鼠腓肠肌指数

由图1可知，模型对照组体重最高，UCⅡ干预组、阳性对照组、青年对照组体重依次减小，正常对照组最低。其中模型对照组和UCⅡ干预组小鼠体重分别为58.9 g 和57.8 g，显著高于正常对照组（46 g）（P＜0.05）。UCⅡ干预组腓肠肌指数为0.44%，显著高于模型对照组（0.27%）（P＜0.05）。

图1 db/db 小鼠体重和腓肠肌指数Fig.1 The body weight and gastrocnemius index of db/db mice

2.2 老年db/db 小鼠骨形态计量学参数

由表1可以看出，模型对照组骨密度最小，与UCⅡ干预组、阳性对照组和青年对照组呈现统计学差异（P＜0.05），UCII 干预显著提高老年db/db 小鼠、老年正常小鼠骨密度（P＜0.05）。UCⅡ干预组的骨小梁相对体积和骨小梁数量最大，阳性对照组、正常对照组、青年对照组、模型对照组依次减小，其中，模型对照组骨小梁相对体积、骨小梁数量分别小于正常对照组、阳性对照组和UCⅡ干预组（P＜0.05）。

表1 db/db 小鼠骨形态计量学Table 1 The bone morphometry of db/db mice

2.3 老年db/db 小鼠爬网能力

由图2可知，爬网时间最长的为正常对照组，分别为模型对照组、阳性对照组和UCⅡ干预组的9.81 倍、8.84 倍和6.02 倍，UCⅡ干预显著提升了模型对照组的爬网时间（P＜0.05）。

图2 db/db 小鼠爬网时间Fig.2 The crawl time of db/db mice

2.4 老年db/db 小鼠步态参数分析

2.4.1 db/db 小鼠步态距离参数的测定 由表2可以看出，右后肢步幅和左前肢步幅在各组之间差异不显著（P＞0.05），老年db/db 小鼠步幅周期显著高于正常小鼠（P＜0.05），经过UCⅡ干预，老年db/db 小鼠右前肢步幅、左后肢步幅显著增加（P＜0.05）。

表2 db/db 小鼠步态距离参数测定结果Table 2 Results of the distance parameter of catwalk in db/db mice

2.4.2 db/db 小鼠步态时间参数的测定 由表3可以看出，5 组间右后肢摆动时长差异不显著（P＞0.05），老年db/db 小鼠右前肢摆动时长、左后肢摆动时长显著高于青年db/db 小鼠和正常小鼠（P＜0.05），经过UC 干预显著降低摆动时长（P＜0.05）。各组摆动速度最快的为UCⅡ干预组，其右前肢、右后肢和左后肢摆动速度显著大于模型对照组（P＜0.05）。

表3 db/db 小鼠步态时间参数测定结果Table 3 Results of the time parameter of catwalk in db/db mice

2.4.3 db/db 小鼠步态支撑相的测定由表4可知，各组右肢支撑相间差异并未存在统计学意义（P＞0.05），并且UCⅡ干预并未显著改变四肢支撑相时相（P＞0.05）。

表4 db/db 小鼠步态支撑相测定结果Table 4 Results of the duty cycle of catwalk in in db/db mice

2.4.4 db/db 小鼠步态协调性相关参数的测定由表5可知，各组步序比并未显示统计学差异（P＞0.05）。老年db/db 小鼠步速显著低于其余各组小鼠。UCⅡ干预显著提升老年db/db 小鼠步速和步调，并且提升步调的效果显著优于阳性对照组（P＜0.05）。

表5 db/db 小鼠步态协调性相关参数Table 5 The coordination of catwalk in in db/db mice

2.4.5 db/db 小鼠腓肠肌指数、骨骼与步态特征相关性分析 由表6可知，小鼠步态相关特征和爬网时间与其腓肠肌质量、骨密度存在一定的相关性。其中腓肠肌指数与爬网时间之间有一定的联系（P＜0.05，系数＞0.5）。小鼠腓肠肌指数与小鼠后肢支撑相呈现显著的正相关关系（P＜0.05，系数＞0.5）。小鼠骨密度与右后肢摆动时长呈现一定的负相关关系（系数＞0.5）。骨密度与爬网时间、左后肢支撑相、后肢摆动速度呈现一定正相关关系（系数＞0.5），其中骨密度与后肢摆动速度、左后肢支撑高度正相关（P＜0.05）。

表6 db/db 小鼠腓肠肌指数、骨骼与步态特征的相关性分析Table 6 The correlation analysis between gastrocnemius index，bone mineral density and catwalk indexes of db/db mice

3 讨论

报道指出，与血糖正常的老年人相比，糖尿病老年患者四肢肌肉和腿部伸展力量明显下降[10]。胰岛素抵抗（IR）通过抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）通路，降低了蛋白质合成，IR促进叉头状转录因子O1 的磷酸化，从而进一步诱导泛素E3 连接酶肌肉降解因子和肌肉环指蛋白1 的表达，导致肌肉蛋白降解增加[11]。本文发现，老年糖尿病小鼠腓肠肌指数显著低于正常小鼠和青年糖尿病小鼠（P＜0.05）。随着糖尿病患者年龄增大，病程增长，肌肉质量进一步减少，并且出现脂肪浸润现象，加剧IR，造成恶性循环。

研究表明，肌肉减少症的营养治疗方式是膳食补充蛋白质[12]。通过UCⅡ干预，可以明显看到db/db 老年小鼠腓肠肌指数增加至0.44%（P＜0.05）。小鼠的爬网能力也在一定程度上受腓肠肌指数的影响（表6），可能是由于肌肉质量下降导致力量和功能减退。然而，正常对照组db/m 小鼠爬网时间最长，可能原因是其体重显著低于其余各组。

造成糖尿病患者骨质损失的因素，包括血糖控制不佳、低胰岛素血症和糖尿病并发症引起的Ca、P 等矿物质的缺乏[13]。另一方面，糖尿病患者的机体处于慢性炎症状态，由于TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子的分泌增加，激活了核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）通路，从而提高了破骨细胞活性，骨吸收增加，造成骨丢失[14]。本文发现，db/db 老年小鼠骨密度显著低于青年db/db 小鼠（P＜0.05），db/db 老年小鼠骨小梁相对体积、骨小梁数量显著低于正常小鼠（P＜0.05），UCⅡ和氨糖硫氨酸干预可有效改善老年db/db 小鼠骨密度和骨小梁的结构（P＜0.05）。增龄导致肌肉萎缩，从而使得肌肉无法给骨骼产生足够的应力刺激，导致骨吸收加速，骨小梁数量减少，结构损伤。临床研究表明，Ⅱ型胶原蛋白能升高血清骨钙素水平，增加骨密度[15]，这与其中富含羟脯胺酸有密切关系[16]。

灵活性下降，肌力减弱等生物性原因的相互作用导致了老年人步态的变化，加之糖尿病常见并发症——糖尿病周围神经病变（DPN）使患者在病程早期出现对称性肢体麻木、踩棉花感等症状。糖尿病老年患者表现为步态异常、体态摇摆，因而易跌倒。其表现为：老年db/db 小鼠右前肢、左前肢和左后肢步幅周期，摆动时长均显著高于正常对照组（P＜0.05），与文献[17]报道相似。步幅的减小源于衰老导致的胶原蛋白减少、弹性下降导致的四肢僵硬[18]，UCⅡ干预可有效改善步幅。文献报道，链脲佐菌素（STZ）注射大鼠造模后12 周，DPN模型大鼠出现步行周期显著延长，摆动时长延长、支撑项时相增加，步幅减小、步行速度减小、协调性降低的现象[18]。本文也得到相似的结论，模型对照组的步序比和步调较小，步速显著低于其余各组。微血管病变、感觉运动神经病变、糖尿病足等，导致疼痛、麻木、乏力、平衡障碍，造成步态变化糖尿病可引起骨关节炎和骨质疏松，疼痛引起小鼠步态支撑相时长增加，并且老年糖尿病患者肌肉质量和功能下降，导致拖曳步态，膝关节与地面夹角减小，躯体纵轴严重偏离锤线，步速降低[18-19]。UCⅡ干预可以改善老年db/db 小鼠步态，通过分析腓肠肌指数与步态参数之间的关系，发现UCⅡ干预可以一定程度恢复肌肉质量和功能，缓解疼痛，从而纠正步行姿势，改善步态。综上所述，UCⅡ干预可以显著改善db/db 老年小鼠的步态参数。

本文分析了骨密度与db/db 小鼠运动参数的关系，小鼠骨密度与右后肢摆动时长呈现一定的负相关关系，骨密度与爬网时间、左后肢支撑相、后肢摆动速度呈现一定正相关关系，其中骨密度与后肢摆动速度、左后肢支撑相存在显著正相关关系。文献报道，胶原蛋白可刺激成骨细胞数量增加，降低破骨细胞活性，促进新骨形成，有效维持骨密度，增加骨骼的坚固性[16]。水解的胶原蛋白经小肠吸收后在软骨积累，刺激软骨细胞合成细胞外大分子基质和胶原蛋白，修复受损软骨，回复软骨弹性，改善骨关节炎症状[20]。因此，与老年模型组相比，UCⅡ干预组的骨密度和骨形态学参数明显改善。综上所述，UCⅡ改善db/db 老年小鼠步态参数的作用可能是通过改善骨骼和肌肉的功能实现的。另外，本文发现，在改善db/db 老年小鼠骨骼健康和步行功能方面，UCⅡ干预组的效果强于阳性对照组（硫酸软骨素+氨基葡萄糖），相似结论在其它报道中也有证实[21]。

综上所述，UCⅡ可以改善db/db 老年小鼠的肌肉质量，增加骨密度，并在一定程度上改善db/db 老年小鼠的运动功能，推测其可以通过改善骨退行性疾病提升其运动功能。在后期研究中，将对UCⅡ改善老年糖尿病小鼠运动功能的机制进行深入研究。

4 结论

本研究以正常喂养至老年的db/db 小鼠为模型动物，通过UCⅡ对其进行16 周干预，通过腓肠肌质量、骨密度的测定，骨形态剂量学参数的分析，运动机能的评估，表征UCⅡ对老年db/db 小鼠肌骨系统退行性改变的影响。结果表明：UCⅡ干预组腓肠肌指数、骨密度、骨小梁相对体积和数量明显大于模型对照组（P＜0.05）。UCⅡ干预显著提升db/db 老年小鼠的爬网能力（P＜0.05），显著提升其步幅、摆动速度、步速、步调和步序比，UCⅡ干预显著降低摆动时长、支撑相时长。试验表明，小鼠腓肠肌指数与支撑相时长、爬网时间呈正相关（P＜0.05，系数＞0.5），小鼠骨密度与爬网时间、支撑相时长、摆动速度呈现一定正相关（系数＞0.5），提示UCⅡ可以改善db/db 小鼠由于增龄带来的腓肠肌质量、骨密度的下降，提高其运动能力。