加工食品对ACE活性的影响

王柯诺，从俊峰，顾 双，王向阳

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

随着居民生活水平的不断提高，人们越来越多地食用高能量的食品，加之缺乏锻炼，高血压患者越来越多。肾素-血管紧张素系统（RAS）是人体内调节血压升高的系统，该系统中血管紧张素转化酶（ACE）将血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）水解转化成一种致使血压升高的血管收缩剂——血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），同时使激肽释放酶-激肽系统（KKS）中的降血压物质缓激肽（BK）失活，抑制降压系统，促进升压系统，致使血压升高[1]。适当抑制ACE活性，可能有利于缓解高血压。日常饮食中饮料和坚果等一些加工食品的食用量较大，然而其对ACE 的活性的影响尚不清楚。

血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）作为目前五大类常用的降压药物之一，不仅能降血压，还能治疗心力衰竭、慢性肾功能衰竭等一些高血压，并发症[2]，然而长期食用此类化学合成的ACEI，常伴随干咳、水肿、肾功能损伤、高血钾等不良反应，心血管、呼吸、皮肤等多个系统都受到不同程度的影响，更有患者因此停止用药[3-6]。鉴于此，国内外学者开始寻找安全有效的降压药。食源性ACE 抑制肽逐渐进入人们的视野中。现阶段食源性ACE 抑制肽的研究对象多以食用蛋白质或者食品加工后废弃的下脚料为主，包括乳蛋白和动、植物蛋白[7]，如牛羊乳、鮰鱼皮、虾仁加工副产物、茶渣[8]、米糠[9]、扇贝裙边[10]、利马豆[11]、鱼鳞蛋白[12]等。于志鹏等[13]研究获得鸡蛋蛋白中的FQK、WGK 和ADW三肽，它们能与ACE 的活性口袋S1 和S2 形成氢键相互作用，从而抑制其活性。马莹等[14]从螺旋藻中提取出藻胆蛋白，用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解藻胆蛋白制备ACE 抑制肽，抑制率高达94.30%。Wang 等[15]用胰蛋白酶水解米糠蛋白，进一步分离水解产物得到一种名为F2-a 的新型抗氧化，且能抑制ACE 活性的生物活性肽。Lin 等[16]发现鱿鱼皮明胶酶解产物具有显著ACE 抑制作用，且动物实验表明通过口服给药有降压作用。此外，有研究证实非多肽物质也具有ACE 抑制活性。辣木中所含有的氨基酸甲酯和酚性成分具有ACE 抑制活性，能够降血压[17-18]。Ben Salah 等[19]通过超声合成了新型三唑酮和双三唑酮，毒性低且具有良好的ACE 抑制活性。李春阳等[20]研究发现蓝莓叶中槲皮素和金丝桃苷能显著抑制内皮细胞的ACE 活性，具有舒张血管的作用。Wijesinghe 等[21]从海洋褐藻的乙醇提取物中分离得到5 种褐藻多酚，均具有较强的ACE 抑制活性。

本试验通过水提、醇提和胃蛋白酶酶解日常饮食中常见的坚果、火腿肠等加工食品得到相应的提取物，分别测定提取物与不同饮料的ACE 抑制率，筛选酶解后抑制效果较好的样品，稀释提取液进行进一步试验，以期为新型预防高血压食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1）试验材料 饮料、坚果以及其它加工食品购于浙江工商大学附近的超市。

2）主要试验试剂 胃蛋白酶（1∶3 000），国药集团化学试剂有限公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）、马尿酸（HA）标准品，美国Sigma 公司；ACE 酶，实验室自制，从猪肺中提取，酶比活力为119.2 U/g。

1.2 仪器与设备

R-210 旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司；2-16KL 高速冷冻离心机，美国Sigma 公司；LC-20AT 高效液相色谱仪、UV-2600 紫外分光光度计，日本Shimadzu 公司；A65312906 冷冻干燥机，美国Labconco 公司；D18TS25 台式均质机，艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 坚果及其它加工食品提取物的制备 样品各部位取样，共取30 g 样品，按料液比1∶3 的比例加入蒸馏水，匀浆处理2 min 后，取匀浆液30 mL于培养皿中进行冷冻干燥。称取3 份冻干粉各50 mg，分别加入2 mL 不同的溶剂配置成25 mg/mL的冻干粉溶液，再用3 种不同处理方法进行提取，终体积定容为2 mL：1）水提：加2 mL 水，80℃加热10 min，于15℃，6 000 r/min 离心20 min 后取上清液，于-80℃储存、备用。2）酶解：加2 mL 水，用100 μL 1 mol/L HCL 溶液调节pH 值至2～3，加10 μL 50 mg/mL 胃蛋白酶，37℃反应2 h 后于100℃水浴15 min，加100 μL 1 mol/L NaOH 溶液。冷却后，于15℃，6 000 r/min 离心20 min 后取上清液，于-80℃储存、备用。3）醇提：加2 mL 无水乙醇，于80℃加热10 min。冷却后，于15℃，6 000 r/min 离心20 min 后，将上清液旋蒸除去乙醇后，加同体积10%乙醇复溶，于-80℃储存、备用。

1.3.2 火腿肠和核桃含水量的测定 取样品可食用部分称量鲜重，再置于100℃烘箱中烘至恒重，得到干重，计算含水量。

1.3.3 ACE 酶活性抑制效果的测定[22]取50 μL硼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.3）与50 μL 不同提取液混合（相当于1.25 mg 原料干物质），加入160 μL 于37℃下加热10 min 后的ACE 酶液（质量浓度2 mg/mL）和40 μL 5 mmoL/L HHL 溶液，于37℃下反应15 min，加入150 μL 1 mol/L HCL 终止反应。用0.45 μm 滤膜过滤，采用HPLC 测定酶解产物中马尿酸的含量。水提取液的对照组为超纯水、乙醇提取液的对照组为10%乙醇、酶解提取液的对照组为0.25 mg/mL 的胃蛋白酶经沸水浴后处理的溶液，分别加入反应体系中，进行3 次重复试验。

液相色谱条件：Hypersil ODS2 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：V甲醇∶V超纯水=3∶17，超纯水中含有0.1%三氟乙酸（TFA）；柱温箱温度：30℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：228 nm。

绘制HPLC 测定马尿酸质量浓度的标准曲线：取质量浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/μL 的马尿酸标准液，通过HPLC 测定马尿酸的含量及其对应的峰面积，绘制出如图1所示的标准曲线。曲线方程式为：y=6×107x+109179，R2=0.9999，线性关系良好。检测范围：0.01～0.1 μg/μL。通过对不同样品液所测得的峰面积与标曲的对照，可得马尿酸产量。

图1 HPLC 测定马尿酸质量浓度的标准曲线Fig.1 The standard curve of HA mass concentration determined by HPLC

ACE 酶活单位的定义：37℃下，每1 min 催化生成1 μmoL 马尿酸所需要的酶量（U）。

ACE 酶活力抑制强度：1）饮料样品：抑制强度（△U/mL）=（对照组酶活力-样品组酶活力）/样品体积。2）其它样品：抑制强度（△U/g 干重）=（对照组酶活力-样品组酶活力）/样品干重

ACE 抑制率（%）=（对照组酶活力-样品组酶活力）/对照组酶活力×100

1.3.4 水提醇沉法制备提取物及测定蛋白质含量

各取5 g 火腿肠和核桃的可食用部分，按料液比1∶5 的比例加入蒸馏水，匀浆处理后，于4℃，10 000 r/min 离心20 min 后，取5 mL 上清液，加等量无水乙醇，于4℃静置过夜。4℃，10 000 r/min离心20 min 后分离上清液与沉淀，分别作2 种不同处理：1）取上清液5 mL 旋蒸完全去除乙醇，加入等量超纯水溶解。2）在沉淀物中加5 mL 去离子水。取1 mL，加9 mL 蒸馏水和5 mL 考马斯亮蓝溶液混匀，避光静置2 min，测定波长595 nm 处的吸光度，重复3 次，测定蛋白浓度[23]。另取500 μL溶液，用10 μL 1 mol/L HCL 溶液调pH 值调节至2～3，加10 μL 50 mg/mL 的胃蛋白酶，37℃反应2 h，100℃水浴15 min，加10 μL 1 mol/L 的NaOH溶液。提取物用于ACE 酶抑制率的测定，剂量为1.3.1 节中初步筛选时提取液浓度的十分之一。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 饮料对ACE 的抑制

蒙牛优益C（原味）、娃哈哈AD 钙奶、伊利每益添（原味）、安慕希（希腊风味酸奶原味）具有显著的ACE 抑制作用。其中，蒙牛优益C（原味）、娃哈哈AD 钙奶ACE 抑制作用较强。这些都是牛奶饮料，可能是牛奶中含有抑制ACE 的多肽。其它非牛奶饮料都没有显著的ACE 抑制作用。

2.2 坚果对ACE 的抑制

5 种坚果水提取物没有显著的ACE 抑制作用，开心果反而显著促进ACE 活性。5 种坚果的酶解产物都有显著的ACE 抑制作用，其中核桃和油板栗抑制效果最好，碧根果和瓜子也有较好的抑制作用，开心果的酶解产物抑制作用较弱。油板栗乙醇提取物显著促进ACE 活性，其它4 种坚果乙醇提取物对ACE 也有轻微的ACE 促进作用，但是都没有显著性。

表1 不同饮料对ACE 的抑制Table 1 Inhibition of ACE by different beverages

图2 牛奶对马尿酸产量的影响Fig.2 Effects of milk on the production of hippuric acid

表2 坚果提取液对ACE 的抑制Table 2 Inhibition of ACE by nut extracts

2.3 其它食品对ACE 的抑制

王中王火腿肠、山楂片、枸杞和桂圆水提取物有显著的ACE 抑制作用，徐福记巧克力有显著的ACE 促进作用。火腿肠酶解产物有极显著的ACE抑制作用。枸橘、豆腐和桂圆酶解产物有显著的ACE 抑制作用。乙醇提取物中只有枸橘有显著的ACE 抑制作用，山楂片、桂圆和豆腐等都能显著促进ACE 活性。

表3 其它加工食品提取液对ACE 的抑制Table 3 Inhibition of ACE by other processed foods extracts

2.4 火腿肠和核桃对ACE 的抑制

鉴于具有ACE 抑制作用的主要是酶解产物，因此选择抑制率最高的火腿肠和核桃，进一步验证其抑制作用效果。由表4可知，火腿肠含水量和蛋白质含量均高于核桃。提取液体稀释10 倍后，虽然核桃对ACE 的抑制效果明显下降了，但是还是显著抑制ACE 的活性，而火腿肠反而促进ACE活性，但是没有显著性。

表4 火腿肠和核桃的含水量及提取的蛋白含量Table 4 Water content and protein content of walnut and ham sausage

表5 火腿肠和核桃的胃蛋白酶解稀释液对ACE 的抑制Table 5 Inhibition of ACE by pepsin hydrolysate diluent of ham sausage and walnut

3 结论

在15 种饮料中，蒙牛优益C（原味）、哇哈哈AD 钙奶、伊利每益添（原味）等含牛奶的饮料有显著的ACE 抑制作用，其余不含牛奶的饮料，如康师傅绿茶（蜂蜜茉莉味）、东方树叶（茉莉花茶）等ACE 抑制效果不明显，而康师傅茉莉蜜茶、康师傅红茶（柠檬口味）、王老吉凉茶却促进ACE 活性。5种坚果的酶解产物都有显著的ACE 抑制作用，其中核桃的抑制作用最强。碧根果和开心果的水提物能促进ACE 活性，其中开心果促进作用显著，而核桃、油板栗、瓜子的水提物的ACE 抑制作用较弱。5 种坚果的乙醇提取物均能促进ACE 活性。其它8 种加工食品中，火腿肠的水提物和胃蛋白酶水解物有显著的ACE 抑制作用。几乎所有食品的乙醇提取物都具有促进ACE 的活性。核桃的胃蛋白酶的酶解物在13 种固体加工食品中，ACE 抑制活性最强。