微颗粒对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的影响

娄行行，魏天予，芦红云，陈启和

（浙江大学食品科学与营养系 杭州310058）

阿魏酸酯酶（Ferulic acid esterases，FAEs）是一种能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，使阿魏酸游离出来的羧酸酯酶[1]，在食品和饲料等工业中有着光明的前景。食品工业利用阿魏酸酯酶降解植物细胞壁中阿魏酸酯键，得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。通过阿魏酸酯酶的处理，饲料工业中植物性原材料的细胞壁变的疏松，更容易被禽畜消化利用。研究表明，真菌和细菌都能分泌阿魏酸酯酶[2-3]，然而目前研究较多的是真菌中的黑曲霉。

黑曲霉在工业中有广泛的应用，如在柠檬酸生产以及各种高价值酶产品包括果胶酶、蛋白酶、淀粉葡糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶[4-5]等的生产。虽然曲霉菌是一种重要的工业微生物，但这些丝状微生物中有一个难以控制的特性就是它复杂的形态，它们不仅有致密的小球还有黏性的菌丝[6]。由于以分散菌丝形态存在的真菌可以带来更高的产品收益率，因此其价值一般优于菌丝形成小球形态的真菌[7-8]。合适的菌株形态对发酵的重大作用促使研究者尝试改变真菌的生长特性，相关研究包括一些培养参数的改变，如接种量、转速、培养基配料以及酸碱度[9-12]。已有研究通过对具有合适形态突变体的随机筛选得到了较理想的菌团形态，并改善了半纤维素酶的产量[13]。因而，改善真菌形态已经成为生物技术的一个研究热点。最近发现通过向培养基中添加滑石粉和氧化铝可以控制真菌的形态，其对黑曲霉和其它丝状微生物的形态发展具有强烈的影响[14]。本文通过向黑曲霉ZJUQH 液体深层发酵培养基中添加不同质量浓度的滑石粉、氧化铝和高岭土，探究添加微颗粒对黑曲霉菌丝生长和产阿魏酸酯酶酶活的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基配方

1）菌株 黑曲霉ZJUQH，由本实验室保藏。

2）斜面培养基 20%马铃薯煮出液，1%葡萄糖。

3）基础发酵培养基（质量分数） 22.6%豆粕浸出液、1.035%蛋白胨、0.3% KH2PO4、0.8%Na2HPO4·7H2O、0.01%NaC1、0.02% MgSO4·7H2O、0.005% CaC12，自然pH 值。

1.2 主要材料与试剂

滑石粉颗粒（800 目），上海麦克林生化科技有限公司；三氧化二铝颗粒（200～300 目）、高岭土颗粒（300 目），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；马铃薯，购于超市；豆粕、蛋白胨，生工生物工程股份有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·7H2O、NaC1、MgSO4·7H2O、CaC12，国药集团化学试剂有限公司；阿魏酸甲酯，南通飞宇生物科技有限公司；二甲基甲酰胺、色谱纯级乙腈、甲酸、甲醇，天津四友精细化学品有限公司。

1.3 主要仪器与设备

LC-2010AHT 高效液相色谱仪，日本岛津公司；Beckman 冷冻高速离心机，美国Beckman 公司；L500 台式低速大容量离心机，湖南湘仪有限公司；DCQF-1 超声复频清洗器，上海东大超声仪器有限公司；HYG-Ⅱa 恒温调速摇床，上海欣蕊自动化设备有限公司；Stemi 2000-C 立体显微镜，德国ZEISS 公司；XL-30 ESEM 扫描电镜，荷兰Philips 公司；Hitachi S-3000N 扫描电镜，日本Hitachi 公司；Mastersizer 2000 激光粒度仪，英国Malvern Instruments 公司。

1.4 发酵培养及酶液制备

将微颗粒的质量浓度分别设为0.1，0.5，1，5，10，20 g/L，即在30 mL 的培养基中分别加入0.003，0.015，0.03，0.15，0.3，0.6，3 g 的微颗粒。微颗粒与液体培养基分开灭菌，备用。

菌株接种到配好的PDA 培养基上，放入28℃恒温生化培养箱中培养6 d 后制成孢子悬浮液，按一定接种量（孢子数约107CFU/mL）接种于装有30 mL 液体培养基的250 mL 三角瓶中，置于28℃，180 r/min 的旋转式摇床中培养7 d，分别于3，5，7 d 取样。将菌悬液置于低速离心机中3 000 r/min 离心30 min，取上清液即为粗酶液于4℃冰箱中保存，待用。

1.5 酶活测定

1.5.1 阿魏酸酯酶酶活测定 用一级色谱纯甲醇溶解阿魏酸甲酯配制成50 mmol/L 的阿魏酸甲酯溶液，再用柠檬酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.0）稀释10 倍。取2 mL 稀释后的阿魏酸甲酯溶液重新加热至40℃，加入1 mL 稀释10 倍的粗酶液，混匀。混合物于40℃反应30 min 后加热至100℃，10 min 后终止反应。反应混合物于室温冷却，以蒸馏水代替底物溶液体系为空白对照[15]。

酶解反应后的阿魏酸产物参考文献[16-17]的HPLC 法定量分析，并稍作修改。高效液相色谱条件：流动相为乙腈-0.5%甲酸混合液（V乙腈∶V0.5%甲酸=30∶70），C18 反相柱（250 mm×4.6 mm，4 μm），检测温度30℃，进样量10 μL，检测波长317 nm。阿魏酸酯酶的酶活定义为在40℃，pH 6.0 条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生1 μmol 阿魏酸所需要的酶量为1 个酶活力单位。

1.5.2 阿魏酸标准曲线测定 取阿魏酸标准制品配成1 mg/mL 的标准溶液，依次稀释成100，50，10，8，4，2，1 mg/L 标准溶液，按1.5.1 节中的色谱条件进行HPLC 测定，记录峰面积，以峰面积对标准质量浓度绘制标准曲线。

1.6 蛋白质质量浓度的测定

采用Bradford[18]的蛋白质定量试剂盒法检测发酵上清液的蛋白质质量浓度。取考马斯亮蓝染液平衡至室温混匀，预热分光光度计。将0，1，2，3，4，5，6 μL 牛血清蛋白（BSA）标准溶液（1 mg/mL）分别加入酶标板，加PBS 补足到10 μL；加Bradford 考马斯亮蓝染液190 μL 后混匀，室温放置5～10 min，酶标仪测定波长595 nm 处的吸光度值，以不含BSA 的样品吸光度值作为空白对照，以蛋白质质量浓度（g/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。在样品测定中，取10 μL 发酵液样品和190 μL 考马斯亮蓝染液混匀，室温放置5～10 min，酶标仪测定波长595 nm 处的吸光度值。随后根据标准曲线计算出样品中所含的蛋白质质量浓度，用于阿魏酸酯酶比活力的计算。

1.7 生物量的测定

将各菌株的发酵液置于离心杯中，于3 000 r/min 离心30 min，收集菌丝沉淀，用与发酵液体积相等的蒸馏水洗涤并离心，重复3 次，最后将所得菌丝体于60℃烘干至恒重，对应减去微颗粒的质量，即得生物量。

1.8 显微镜观察及粒度分布

1）菌体微观形态观察 用立体显微镜观察菌团，然后通过预处理，用XL-30 ESEM 扫描电镜对菌团进行更细致的观察。

2）菌体粒度分析 用Hitachi S-3000N 扫描电镜在20 kV 下观察微颗粒，然后用Mastersizer 2000 激光粒度仪测定样品的粒度分布。

2 结果与分析

2.1 微颗粒对黑曲霉发酵产阿魏酸酯酶的作用

从图1中可以看出，与对照组相比，添加微颗粒对阿魏酸酯酶的酶活产生一定的影响。这种影响与微颗粒的种类、添加微颗粒的质量浓度以及发酵时间都有关。由图1a 和1b 可知，发酵第3天，添加微颗粒组的阿魏酸酯酶的酶活均高于对照组；发酵第5 天，当滑石粉和氧化铝质量浓度的增大到一定程度时（滑石粉>5 g/L，氧化铝>1 g/L），阿魏酸酯酶的酶活受到抑制；发酵第7 天，高质量浓度的滑石粉和氧化铝对阿魏酸酯酶活性的抑制情况有所改善。由图1c 可以看出，高岭土的添加会提高黑曲霉产阿魏酸酯酶的酶活。综上，添加高岭土对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳。整体来看，3 种微颗粒均是在发酵第5 天、质量浓度为0.5 g/L 时，阿魏酸酯酶酶活最高。

图1 添加滑石粉、氧化铝和高岭土对黑曲霉ZJUQH 产阿魏酸酯酶比酶活的影响Fig.1 Effects of talc，alumina and kaolin on FAEs specific activity produced by Aspergillus niger ZJUQH

2.2 微颗粒对液体深层发酵中黑曲霉生物量、菌团大小以及形态的影响

为揭示添加氧化铝、滑石粉和高岭土对液体深层发酵中黑曲霉生长的影响，比较了发酵第5天时的黑曲霉生物量。从图2可以看出，高岭土对菌丝生长具有负面作用，而高岭土对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳（图1），表明细胞的积累可能与阿魏酸酯酶酶活的提高无关。0.5 g/L 滑石粉有利于菌丝生长，然而随着培养基中滑石粉质量浓度的增加，菌丝生长减慢，表明少量添加滑石粉可以促进菌丝生长，过量添加滑石粉会抑制菌丝生长。

由图3可知，添加微颗粒后菌团直径均小于对照组（2.2 mm），并且添加微颗粒的质量浓度越大，菌团直径越小。除改变菌团大小外，添加微颗粒还会改变真菌菌丝的结构。由图4可以看出，与对照组相比，添加微颗粒后菌丝体比较松散，菌丝不完整。其中，添加0.5 g/L 高岭土对菌丝体表面结构的影响最大。微颗粒影响真菌菌丝形态可能有2 个方面的原因：一是悬浮的微颗粒在菌团开始形成时阻止了菌丝的聚集，二是菌团形成后摇瓶培养使微颗粒与菌团之间相互碰撞、剪切造成菌团被破坏[19]。整体来看，3 种颗粒中，高岭土对菌团大小和菌丝结构的影响最大，这可能与高岭土的结构有关。由图5可以看出氧化铝颗粒一般是圆形的，高岭土颗粒一般呈尖锐的不规则形状，而滑石粉颗粒的形状则介于两者之间。相比于光滑的、规则的氧化铝颗粒，尖锐的不规则形状的高岭土颗粒对菌丝聚集产生的破坏作用更大。

3 讨论

丝状真菌广泛应用于工业生产中。在深层培养过程中，它们表现出与产量相关的复杂的形态学周期（从稠密的球形颗粒转变为松散的菌丝），这对培养过程优化非常有利[20]。碳源的类型和浓度以及氮源、磷酸盐、微量元素，溶解氧和二氧化碳、pH 值和温度等因素都影响着真菌的形态；另外培养容器或者生物反应器的几何学、搅拌系统、流变学以及培养基的类型都调节着培养中菌丝的形态[21]。本研究发现，黑曲霉产阿魏酸酯酶会受到3 种微颗粒的影响，添加微颗粒的不同对酶活的影响也不同，其中高岭土对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高效果最为显著。在适当的发酵时间和适当的质量浓度下，氧化铝和滑石粉也有利于提高黑曲霉产阿魏酸酯酶的酶活。然而，添加微颗粒对真菌菌丝的生长产生了负面影响。微颗粒对真菌细胞积累的影响与对酶活的影响产生了相反的效果，说明了黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高不是单纯的黑曲霉细胞积累的作用。先前的研究也显示了微颗粒似乎能提高酶的活力、增加酶的产量，却使生物量不变或减少[14]。这些都表明微颗粒对真菌细胞的作用不是一般的代谢调控刺激，而是真菌细胞在微颗粒存在下发生了一系列细胞生理学方面的复杂变化[10，22]。

图2 添加滑石粉、氧化铝和高岭土对黑曲霉ZJUQH 生物量的影响Fig.2 Effects of talc，alumina and kaolin on biomass of Aspergillus niger ZJUQH

图3 添加滑石粉、氧化铝和高岭土对黑曲霉ZJUQH 菌团大小的影响Fig.3 Effects of talc，alumina and kaolin on average pellet diameter of A.niger ZJUQH

图4 添加微颗粒培养120 h 后的黑曲霉ZJUQH 电镜照片Fig.4 SEM examination of A.niger ZJUQH after adding microparticles for 120 h

图5 滑石粉、氧化铝和高岭土微颗粒电镜结果（300×）Fig.5 SEM images of talc，alumina and kaolin（300×）

丝状真菌的特殊形态使它特别容易形成菌团，菌团逐渐变大会导致细胞生长过程中氧气和营养供应不足[6，8，23]。添加微颗粒后，菌团的平均粒径显著减小，氧气的传递就更加充分，有利于特定蛋白质的产生，这可能是添加微颗粒后黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活提高的原因。在3 种微颗粒中，高岭土对菌团平均粒径的影响最为显著，并且高岭土对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高效果也最为显著，因此黑曲霉菌团大小与黑曲霉产阿魏酸酯酶的酶活大小可能存在一定关系。本研究选用了3 种颗粒大小和形态不同的微颗粒进行探究，发现它们对黑曲霉菌丝形态的影响存在差异，因此可以通过改变微颗粒的大小和浓度精确地调整丝状微生物的形态[14]。微颗粒的微观研究进一步证实微颗粒对菌丝的影响主要是通过调节菌丝形态和内部结构来实现的。有研究已经证明，向培养基中添加滑石粉和氧化铝强烈地影响了黑曲霉和其它丝状微生物的形态[14，24-25]。丝状微生物形态的改变对其产代谢物也有一定的影响。在摇瓶发酵的黑曲霉小菌落中，不同部位基因表达水平是不一样的，mRNA 的积累也存在着差异[26-27]。小菌落的外围的每个菌丝中RNA 的含量大约是中心的45倍[26]，这种差异对代谢酶的合成也有一定的影响。故微颗粒也可能通过改变黑曲霉的菌丝形态影响合成阿魏酸酯酶基因的表达。

4 结论

本研究探究3 种微颗粒在黑曲霉深层发酵过程中对丝状真菌细胞形态和菌株产酶酶活的影响。研究发现，表面尖锐并呈不规则状的高岭土颗粒对黑曲霉菌丝形态的影响最大，同时对黑曲霉产阿魏酸酯酶酶活的提高也最大，说明真菌产酶的酶活大小可能受到丝状真菌形态的影响。因此，无论在研究还是工业应用上，若要增大菌株产酶的活力或者产量，可以通过添加微颗粒控制菌丝形态来实现。这种添加微颗粒改变菌丝形态的方法为更好地探究丝状真菌代谢能力提供了一条有效途径。