氢气对实验性小鼠过敏性鼻炎减轻作用的研究*

严伟明 龙 盘 杨健松 危冬昱 张宇飞 陈梅珠 张作明 陈 涛

(1. 中国人民解放军空军军医大学航空航天临床医学中心,西安 710032)(2. 中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院 福建医科大学福总临床医学院 厦门大学附属东方医院,福州 350025)(3. 中国人民解放军西部战区总医院 成都 610083)(4. 中国人民解放军94755部队卫生所,漳州 363000)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻喉-头颈外科的常见病，也是常见的呼吸道变应性疾病，影响全球10 %～40 %的人口。AR主要症状为鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻塞等，严重时明显影响日常生活[1]。研究发现，氧化应激参与了AR的发生、发展过程[2]。此外炎性介质释放引发的持续性炎症反应也是AR的一种重要发病机制[2]。当前鼻用糖皮质激素为治疗AR的首选药物，然而激素带来的潜在副作用往往限制其较广泛的运用。寻求针对AR一种有效的副作用少的治疗药物具有重要临床意义。

氢气是一种新型抗氧化剂，同时也被报道具有抗炎作用，其无色无味，且未见报道有副作用。运用氢气对相关疾病进行治疗研究已成为医学研究领域的热点之一[3]。氢气发挥生物学效应的机制主要涉及减轻氧化应激及减少炎症因子[4]。本研究拟运用吸入氢气的方式，构建小鼠过敏性鼻炎模型，借助氢气抗氧化、抗炎作用，观察其能否对过敏性鼻炎起到治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组：BALB/c小鼠24只，雌性，7周龄，购于空军军医大学实验动物中心实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2019-001。饲养环境：温度为(23±2)℃，相对湿度为 55%±10%，光照周期为12 h/12 h。动物体质量从小到大依次编号为 1，2，3，…24号，对于每一个编号，分别给予一个随机数字。按编号1～24，4只/组，共6个小组；小组内按相应的随机数字进行排序，分别标记为“1”“2”“3”“4”，每个标记各6只，相应归为A组(正常组)、B组(模型组)、C组(氮氧组)和D组(氢氮组)。

1.1.2主要试剂及设备：卵白蛋白(ovalbumin，OVA，Sigma #SLBH0950V)；氢氧化铝[alumin，Al(OH)3,天津市天力化学试剂有限公司，批号20120808]；生理盐水(normal saline，NS，华仁药业股份有限公司，产品批号F1501051)；脱钙液(10% EDTA Na，购于空军军医大学试剂中心)；微量进样器(50 μL，上海高鸽工贸有限公司)；氢氧混合气体(66.7% H2和33.3% O2)，由氢氧气雾化机(上海潓美医疗科技有限公司)电解双蒸水生产，主要由电解槽系统和超声雾化系统共同作用，将交流电压转直流电压后，通过电解槽系统的两电极，纯水在直流电压产生的电场和在少量食品级催化剂(食品碱)作用下发生电解效应，产生氢气和氧气，即：2H2O=2H2↑+O2↑；氮氧混合气体(66.7% N2和33.3% O2)，产品编号10021120#，由陕西兴化化学股份有限公司光明特气分厂配制；组织包埋机(YABO400，常州市雅博电子设备有限公司)；自动脱水机(YABO600，常州市雅博电子设备有限公司)；旋转石蜡切片机(Finesse 325，上海赛默飞世尔仪器有限公司)；自动恒温摊片烤片机(GTK-2002，西安瑞丰仪器设备有限公司)；显微镜照相系统(BX51，奥林巴斯公司)。

1.2 过敏性鼻炎模型的建立及实验干预

1.2.1过敏性鼻炎小鼠模型的建立：参考文献进行过敏性鼻炎模型构建[5]。①基础致敏：每只小鼠按50 μg OVA +2 mg Al(OH)3溶于0.3 mL NS，每2天一次，持续两周，腹腔注射；②鼻腔激发：第15～21天，每只小鼠两个鼻腔各点一滴(约10 μL)内含200 μg OVA生理盐水溶液。

1.2.2实验干预：A组小鼠不给予任何处理(不造模、不干预)；B组给予过敏性鼻炎造模处理；C组小鼠在造模过程中，每天在密闭箱中吸入氮氧混合气体(66.7% N2+ 33.3% O2)2 h，流量3 L/min；D组小鼠在造模过程中，每天在密闭箱中吸入氢氧混合气体(66.7% H2+ 33.3% O2)2 h，流量3 L/min。采用便携式气体检测报警器仪(PGM-1600，上海华瑞科学仪器有限公司)对密闭箱中的气体进行氢气浓度监测，并采用氧气浓度仪进行氧气浓度测量，确保精确吸入固定浓度和比例的混合气体。

1.3 检测指标

1.3.1小鼠鼻炎症状行为学观察(搔鼻子及打喷嚏)：从造模过程鼻腔激发阶段(第15～21天)，每天对各组小鼠鼻腔给药10 min内，观察并计数小鼠搔鼻子及打喷嚏次数，连续记录7 d。

1.3.2鼻黏膜病理组织苏木素-伊红(HE)染色观察嗜酸性粒细胞计数：第21天观察小鼠鼻炎症状后，统一颈椎脱臼处死各组小鼠，解剖获取鼻腔，于脱钙液中浸泡30 d；将组织进行固定、脱水、包埋、切片及HE染色，制作小鼠鼻腔HE染色病理组织切片；在高倍镜(×400)下，选取右侧鼻腔鼻中隔5个视野，进行嗜酸性粒细胞计数，并取平均数，相应记录。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 行为学观察

2.1.1搔鼻子次数:鼻腔激发7 d内，除正常组外，其余三组小鼠搔鼻子次数均较多，大致均呈逐渐增加趋势(图1)。鼻腔激发第1～2天，模型组、氮氧组与正常组搔鼻子次数的差异均有统计学意义(P<0.05)；氢氧组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05)，而模型组、氮氧组和氢氧组三组两两间差异无统计学意义(P>0.05)。鼻腔激发第3～6天，各组间搔鼻子数差异无统计学意义。鼻腔激发第7天，模型组、氮氧组与正常组搔鼻子次数的差异均有统计学意义(P<0.05)；氢氧组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05)，而三组两两间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

图1 各组小鼠搔鼻子次数统计折线图注： *P<0.05Fig.1 The statistical broken-line graph of the numberof nose-scratching of mice in each groupNote: *P<0.05

表1 各组小鼠搔鼻子次数统计表Table 1 The statistical table of the number of nose-scratching of mice in each group

2.1.2打喷嚏次数:鼻腔激发7 d内，除正常组外(正常组小鼠未观察到有打喷嚏现象)，其余三组小鼠打喷嚏次数较正常组多，大致呈逐渐增加趋势；每天内模型组与正常组间差异均有统计学意义(P<0.05)；每天各组间打喷嚏次数差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)，具体如下：鼻腔激发第1～2天，模型组、氮氧组分别与正常组间打喷嚏次数差异均有显著统计学意义(P<0.01)，氢氧组与正常组间差异有统计学意义(P<0.05)，模型组、氮氧组和氢氧组三组两两间间差异无统计学意义(P>0.05)；鼻腔激发第3～4天，模型组、氮氧组分别与正常组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)，氢氧组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05)，模型组、氮氧组和氢氧组三组两两间差异无统计学意义(P>0.05)；鼻腔激发第5天，模型组、氮氧组分别与正常组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)，氢氧组与正常组间差异有统计学意义(P<0.05)，而三组两两间差异无统计学意义(P>0.05)；鼻腔激发第6天，模型组、氮氧组、氢氧组分别与正常组间差异均有统计学意义(P<0.05)，而三组两两间差异无统计学意义(P>0.05)；鼻腔激发第7天，模型组、氮氧组、氢氧组分别与正常组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)，氮氧组、氢氧组分别与模型组间差异均有显著统计学意义(P<0.01)，氢氧组与氮氧组间差异有显著统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 各组小鼠打喷嚏次数统计表Table 2 The statistical table of the number of sneezing of mice in each group

图2 各组小鼠打喷嚏数统计折线图注：*P<0.05Fig.2 The statistical broken-line graph of thenumber of sneezing of mice in each groupNote:*P<0.05

2.2 病理组织学观察

在鼻腔黏膜病理组织HE染色切片上，模型组、氮氧组和氢氧组小鼠鼻腔均可见嗜酸性粒细胞(细胞质呈红色，呈颗粒感，细胞核呈分叶状)，正常组小鼠未观察到(图3)。在高倍镜下，正常组、模型组、氮氧组、氢氧组的嗜酸性粒细胞计数分别为0，32.2±3.426，24.4±3.868和 19.2±2.396个；模型组、氮氧组、氢氧组分别与正常组间嗜酸性粒细胞计数差异均有统计学意义(P<0.01)；氢氧组嗜酸性粒细胞计数较模型组、氮氧组少，差异均有统计学意义(P<0.01)，而氮氧组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

图3 各组间小鼠鼻中隔黏膜病理组织切片HE染色典型图(Bar=10 μm)Fig.3 Typical image of HE staining of the histological sections of the mucosain the nasal septum of mice in each group (Bar =10 μm)

图4 各组间小鼠鼻中隔黏膜病理组织切片黏膜嗜酸性粒细胞计数统计图注:正常组未观察到；与正常组相比，**P<0.01; 与氮氧组相比，##P<0.01Fig.4 The statistics chart of the eosinophil numbercounted in the histological sections of the mucosain the nasal septum of mice in each groupNote:Not detected in the normal group；Compared with the normal group,**P<0.01；Compared with the nitrogen-oxygen group, ##P<0.01

3 讨论

过敏性鼻炎临床典型症状包括鼻痒、阵发性喷嚏，表现为患者阵发性打喷嚏、搔鼻子，病理组织学表现为毛细血管扩张，血管通透性增加，嗜酸性粒细胞浸润[6]。本研究参考文献构建的过敏性鼻炎小鼠模型，造模的小鼠打喷嚏次数明显增加，且在鼻腔黏膜病理组织HE染色切片上观察到过敏性炎症的特征性细胞——嗜酸性粒细胞(细胞质呈红色，有颗粒感，细胞核呈分叶状)，而在正常小鼠中未发现有嗜酸性粒细胞。因此说明过敏性鼻炎小鼠模型建立成功，与上述过敏性鼻炎症状行为数据相吻合。

Sim等[7]研究发现过敏性鼻炎患者其体内氧化应激水平明显升高。氧化应激可破坏上皮纤毛的完整性和功能并改变黏附分子的表达，导致渗透黏膜和黏液产生增加，从而参与AR的发病过程。Guo等[8]研究发现抗氧化剂可通过清除氧自由基治疗过敏性鼻炎。此外，研究显示在AR患者和动物模型中鼻腔灌洗液中，白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13和IL-17等炎症因子水平明显升高[9-10]，提示炎症反应也是AR发病中的另一重要作用环节。在AR中，氧化应激与炎症这两种机制相互作用，相互调节促进AR的发生、发展[11]。

氢气是一种新型抗氧化剂，可清除强效氧自由基，如—OH和ONOO—[12-13]，可起到生物学保护效应。研究发现呼吸高压强的氢气可治疗寄生虫引起的肝炎，证明氢气具备抗炎特性[14]。氢气可通过抑制炎症性组织损伤，降低炎症因子和细胞因子，如白介素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞黏附分子-1和前列腺素E2等[15]，减轻组织器官损伤[16-17]。

本研究利用氢氧气雾化机电解双蒸水产生含高浓度氢气的混合气体(66.7% H2和33.3% O2)干预AR小鼠，作为对照的小鼠给予吸入氮氧混合气体(66.7% N2和33.3% O2)，借用氢气的抗氧化、抗炎作用尝试去治疗过敏性鼻炎，从小鼠行为学及病理组织学结果发现氢气对小鼠过敏性鼻炎症状(打喷嚏次数)及病理组织学改变(鼻腔黏膜嗜酸性粒细胞计数)有减轻作用。我们观察到正常组小鼠也有搔鼻子的现象，可能是其在进行脸面清洗，而对其余三组小鼠，人为观察可能不容易将此动作与真正因鼻炎引起鼻痒而进行搔鼻子的动作区别开来。这可能是本研究中小鼠搔鼻子次数指标中未见到吸氢小鼠与其他组明显差异的原因。

前期有研究显示应用富含氢气的生理盐水干预AR鼠，发现其可通过降低血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平来抑制活性嗜酸性粒细胞[18]；另有研究应用富含氢气的生理盐水辅助治疗AR患者，结果证实其对AR患者过敏症状也有一定改善作用[19]。文献报道吸入氢气在多种疾病模型中有较好的治疗效果，相对于腹腔注射氢水的形式，吸入氢气所可提供的氢气浓度较高，在体内达峰时浓度较大，持续时间较长[20-22]。因此，在某种意义上，吸入氢气能取得更佳的疾病防治效果。本研究运用吸入氢气形式干预AR的结果与上述氢气其他研究结果相吻合。

值得关注的是，本研究结果可见氮氧混合气体、氢氧混合气体处理均能减轻过敏性鼻炎小鼠打喷嚏症状，而氢氧混合气体处理组的效果更佳，说明氢气对过敏性鼻炎打喷嚏症状有一定的减轻作用。而氮氧混合气体组小鼠打喷嚏症状较模型组有所减轻，是否可以说明33.3%氧对过敏鼻炎也有一定的影响？目前未查阅到这方面相关文献报道，有待后续相关研究进一步证实。Fang等[23]的研究中，其用氮气将吸的氧气浓度稀释为21%，与周围环境相同，排除了高浓度氧气的影响在小鼠身上，其研究结果也发现氢气可以减轻小鼠过敏症状。这与本研究结果相符合。

综上所述，本研究数据说明高浓度氢气吸入对小鼠过敏性鼻炎有一定的治疗作用，其发挥作用的深入具体机制有待进一步实验探讨。