DRD1基因敲除影响雄鼠生育的分子机理研究*

龚晓娟 马 盼 孙 敏 杨婧思 李少卿王兴林,2 张 平 阎春霞 张 宝

(1. 西安交通大学卫生部法医学重点实验室，西安 710061)(2. 西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，西安 710061)

动物生殖性状主要受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)的调控，关于动物生殖的研究大多是集中在HPG轴分泌的激素及其受体基因上[1]。其中，多巴胺(dopamine，DA)占哺乳动物大脑中儿茶酚胺类神经递质含量的80%，控制着运动、认知、情感、摄食、内分泌调节等多种功能[2-4]。已知的多巴胺受体(DR)有5种(D1～D5)，可分为D1样家族受体和D2样家族受体。多巴胺D1受体属于DR1样受体，主要表达于尾壳核(CPu)、伏隔核(Acb)、视束(OT)、脑皮层(Cx)和杏仁核[5]，其功能主要包括影响情感思维及神经内分泌(帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默症)、参与药物依赖形成、调控精神分裂症、认知功能、影响学习记忆能力、保护视神经等。在小鼠体内定向敲除DRD1基因会提供关于它们生理功能的有研究价值的信息。例如，在各种海马依赖的空间任务中，DRD1基因敲除小鼠学习和记忆能力明显下降[6-7]。一些研究表明DRD1基因在下丘脑和垂体中广泛表达，且该基因的表达参与鸡、鸭、鹅等禽类生殖行为的调节[8-10]。但是DRD1基因调控生殖力的作用及其分子机制尚不清楚。为了进一步探究DRD1基因对生殖功能的影响，解析我校饲养的DRD1敲除小鼠表现的生殖能力下降，仔鼠成活率低等现象，本研究以DRD1敲除小鼠为研究对象，对DRD1敲除雄性小鼠的生殖性状进行分析，旨在探究DRD1在雄性生殖功能中发挥的作用，明确DRD1敲除小鼠生殖能力下降的分子机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：DRD1-/-小鼠(KO)、C57BL/6小鼠(WT)购自西安交通大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2018-001。多巴胺DRD1基因敲除小鼠(KO)，由美国芝加哥大学(University of Chicago)徐明教授惠赠。

1.1.2试剂仪器： RNA提取试剂盒(上海宝曼生物科技有限公司)，反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa BIO INC)，PCR仪和qRT-PCR仪(Bio-Rad)，组织切片机(Leitz)。

1.2 方法

1.2.1饲养条件：实验动物饲养在西安交通大学医学部实验动物中心按照SPF级标准饲养，实验动物使用许可证号: SYXK(陕)2015-002，温度控制在18～22 ℃，相对湿度控制在50%～60%，光照明暗交替12 h/12 h。鼠盒、垫料均经过高压消毒(131 ℃、5 min)，饲料用60Co照射灭菌，由北京科澳协力饲料有限公司提供，动物饮用水为酸化纯净水(pH 2.5～3.0)。饲料、水供给充足，垫料每2～3天更换1次。

1.2.2样本收集：DRD1-/-纯合小鼠经过检验检疫、测序鉴定，检测合格后进行分组实验。取8周龄SPF级DRD1-/-雄性小鼠和WT雄性小鼠各5只。测小鼠体质量，取出小鼠双侧睾丸，称质量，计算睾丸脏器系数。一侧睾丸在筛网中用TRIzol充分研磨，-80 ℃保存；另一侧睾丸用4%多聚甲醛/PBS固定。

1.2.3组织学分析：4%多聚甲醛溶液固定的睾丸组织常规石蜡包埋、组织切片、HE染色、中性树胶封片、制作成睾丸组织病理切片，光学显微镜下观察。对每个睾丸组织切片，选取 10 个圆形生精小管上皮，观察生精小管的直径及精原细胞，各级生精母细胞的分布及形态，睾丸间质的疏密程度及分布情况。

1.2.4基因表达差异分析:查阅文献，选择在睾丸组织中显著表达并与生殖密切相关的8个候选基因：Spem1、Tex12、Spata19、Tnp2、CDY、CFTR、DAZ、SMCY以及内参基因GAPDH。利用TRIzol法提取睾丸组织RNA，经gDNA Eraser酶参照说明去除基因组DNA，反转录合成cDNA后进行qRT-PCR反应。结果分析采用相对定量法，根据2-ΔΔCt数值判断实验组某基因相对于对照组的表达量，以GAPDH作为内参。ΔCt=目标基因Ct值-内参基因Ct值；ΔΔCt=实验ΔCt-对照ΔCt；相对表达量=2-ΔΔCt。一般认为2-ΔΔCt数值大于2表达上调具有显著意义，小于0.5表达下调具有显著意义[11]。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 体质量及脏器系数计算

KO雄鼠体质量与WT雄鼠体质量相比具有显著差异(P<0.05)；KO 鼠睾丸质量与WT鼠睾丸质量相比，未发现显著差异(P>0.05)；KO 鼠睾丸系数与WT鼠睾丸系数相比，也未发现显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 KO与WT小鼠体质量及睾丸系数比较Table 1 Weight and testicularcoefficient in KO and WT

2.2 睾丸组织病理切片

肉眼观察，睾丸组织未发现显著差异。光学显微镜下观察睾丸组织病理切片，与 WT 小鼠相比，发现KO 小鼠生精小管排列疏松紊乱，生殖细胞层数少。虽可见圆形精子，但精细胞与带尾精子数量较少，提示精子形态及功能可能存在异常(图1)。

图1 WT与KO小鼠睾丸组织病理切片比较Fig.1 Comparison of pathological sectionsof testis tissue between WT and KO

2.3 qRT-PCR分析结果

KO小鼠相对WT小鼠，CFTR表达上调2.32倍，Spata19上调4.58倍，SMCY下调5.25倍，DAZ下调3.14倍，Tex12、CDY、Spem1和Tnp2未见明显差异(图2)。

图2 WT与KO小鼠基因表达差异倍数Fig.2 Fold change in differential gene expressionbetween WT and KO mice

3 讨论

多巴胺DRD1基因被认为与精神分裂症、药物依赖、孤独症等多种精神类疾病相关，在下丘脑和垂体中有着广泛分布，DRD1-/-小鼠，作为多巴胺受体介导的神经及生理活动动物模型被广泛应用于药物成瘾、精神分裂等的研究[12-15]。本实验室在对该动物模型进行饲养的过程中，发现DRD1-/-小鼠出现生殖能力下降、仔鼠成活率低等现象。由于动物生殖主要受下丘脑-垂体-性腺轴的调控，而DRD1基因在下丘脑和垂体中广泛表达，推测DRD1基因可能通过下丘脑-垂体-性腺轴参与小鼠生殖的调控。故本研究从病理生理学指标及基因表达水平对DRD1-/-雄性小鼠睾丸生殖功能进行分析，以期为生殖生理的研究提供新的思路。

CFTR编码囊性纤维化跨膜转运调节因子，在呼吸道、肠道、生殖道等腔上皮细胞内多有表达，其突变可以导致多种发育缺陷的发生。大量研究表明，CFTR的突变和蛋白表达异常是男性生殖道中先天性输精管缺如[16]、男性梗阻性无精子症及不育的重要因素[17]。但关于CFTR对生精功能是否造成影响，学术界一直存在争议，CFTR在睾丸上的表达分布情况也鲜有报道。有研究表明先天性双侧输精管缺如患者睾丸组织的CFTR表达以阳性和弱阳性为主，也可见强阳性和少部分的阴性[18]。本研究发现DRD1-/-小鼠CFTR睾丸上表达上调2.32倍，推测DRD1基因敲除损伤睾丸生精功能可能与CFTR表达异常有关。Spata19是与生殖相关的一个重要的基因，已被鉴定与精子发生及前列腺癌等其他重要生殖疾病有关。Spata19通过调控线粒体功能影响精子活动性[17]，可影响精子头部的形状[19]，在精子的发生过程中起重要的作用[20]。本研究检测到DRD1-/-小鼠的Spata19基因表达上调4.58倍，刘若岩[21]研究表明该基因表达水平的增加可能会影响精子的结构稳定，也可能使精子提前获能，从而影响雄性小鼠的生殖功能。

与之相反的是，本研究中KO小鼠的SMCY基因与DAZ基因较WT小鼠表达显著下调，SMCY下调5.25倍，DAZ下调3.14倍，这与组织学水平发现精细胞及带尾精子数量少相一致。SMCY编码一种男性特有的组织相容性抗原，其突变或缺失与无精或少精相关，是一种生精因子[22-23]，DRD1-/-小鼠睾丸组织中SMCY基因表达的下调，证明DRD1基因的敲除影响了睾丸生精功能，损害小鼠的生殖功能。基因DAZ编码在精原细胞和减数分裂早期生精细胞中特异性RNA结合蛋白，是激活精子和保持种族 Y 染色体功能的重要基因[24-26]。DRD1-/-小鼠睾丸组织中DAZ基因表达的下调，会导致精子发生过程中联会的失败，从而致使DRD1-/-小鼠的生精功能低下、生殖功能下降。

以上基因的差异表达对精子的发生发展，睾丸组织的形态具有显著影响。敲除小鼠DRD1基因后，与生殖相关的基因表达发生相应的上调或下调，从而影响生殖器官及精子生成，导致生殖能力下降。由此推测，DRD1基因可能通过影响雄鼠体内与生殖密切相关基因的表达情况，间接影响精子的发生、睾丸组织的形态，进而影响生殖。但其明确的关系，仍需进一步研究。为了明确DRD1基因与小鼠生殖性状及生殖力之间的关系，下一步具体可从KO与WT雄性小鼠的生殖行为学、性激素测定、蛋白组学和高通量分析技术(如基因芯片)等几方面进行深层次研究。本研究从组织学水平，基因水平对小鼠生殖性状的影响进行了初步探讨。DRD1基因如何调控生殖通路的具体靶点，有待进一步探究。