抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎患者细胞因子检测及其临床意义

吕遐 徐晓璐 任海涛 刘曼歌 赵燕环 范思远 朱以诚 崔丽英 关鸿志

抗N-甲基-D天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎是自身免疫性脑炎中最常见的一种类型[1]，其临床表现多样，症状多符合弥漫性脑炎和重症脑炎，对免疫治疗反应较好[2-3]。抗NMDAR抗体是该病的致病性抗体，具有鞘内合成的特征[4]。细胞因子作为重要的免疫调节因子，其功能涉及B细胞招募与分化、浆细胞成熟与抗体分泌等体液免疫过程，以及T细胞分化、细胞毒性等细胞免疫过程。细胞因子在抗NMDAR脑炎中的作用与临床意义有待研究揭示。该研究通过检测抗NMDAR脑炎患者脑脊液与血细胞因子，包括B细胞相关的CXC趋化因子13(C-X-C motif chemokine 13，CXCLl3)、B细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)、诱导增值配体(a proliferation inducing ligand，APRIL)和辅助T细胞相关的白细胞介素6(IL-6)、CXC趋化因子10(C-X-C motif chemokine 10，CXCL10)，旨在探讨其临床意义及与病理机制的联系。

1 对象和方法

1.1 对象收集2015年11月至2017年5月北京协和医院神经科确诊的抗NMDAR脑炎患者50例。患者均符合Graus等的抗NMDAR脑炎诊断标准[5]。另收集中枢神经系统炎性脱髓鞘病21例、非炎性疾病22例为对照组。非炎性疾病对照组符合以下标准：(1)脑脊液细胞学未见明显异常；(2)病程超过3个月；(3)无明确或可疑的中枢神经系统感染；(4)无明确或可疑的视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)或多发性硬化(MS)；(5)无明确或可疑的系统性自身免疫疾病，血清/脑脊液抗核抗体等阴性。该研究经北京协和医院伦理委员会伦理审核批准(编号：JS-891)，患方签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集：包括性别、年龄、起病时间、前驱症状、临床表现、急性期改良Rankin评分(mRS)以及脑脊液、抗体、脑电图与头MRI检查等资料。

1.2.2细胞因子检测：脑脊液与血清标本常温离心后吸取上清，置-60℃冰箱冻存。采用ELISA法检测。CXCL13、BAFF、IL-6和CXCL10 ELISA试剂盒为美国R&D Systems公司产品；APRIL检测采用武汉华美生物工程有限公司试剂盒。根据不同试剂盒建议的拟合方式(log/log双对数轴线性拟合或4-PL拟合)，使用曲线数据拟合平台MyCurveFit对标准品浓度和吸光度值进行拟合以获得标准曲线。根据标准曲线计算样本浓度。

1.3 统计学处理采用SPSS IBM 20.0软件统计分析，采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计制图。对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均值±标准差表示，抗NMDAR脑炎患者不同病程细胞因子(IL-6除外)水平比较采用配对t检验；非正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Dunn’s多重比对检验，抗NMDAR脑炎患者不同病程IL-6水平比较采用Wilcoxon符号秩和检验；细胞因子水平与临床特征的相关性采用Spearman相关分析。以P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脑炎患者临床资料抗NMDAR脑炎患者男女各25 例，年龄2～51岁，平均(21.71±14.06)岁。其中初次诊断患者39例，复发患者11例。急性期患者mRS评分2～5分，平均(4.22±0.89)分，其中初次诊断患者平均(4.36±0.87)分，复发组为(3.73±0.79)分。27例(54%)有前驱症状，起病时表现为精神行为异常者占82%，其他表现依次为抽搐/癫痫发作、言语障碍、意识水平下降、不自主运动等。具体临床特征及辅助检查结果见表1。

表1 50例抗NMDAR脑炎患者临床特征及辅助检查结果〔n(%)〕

2.2 各组细胞因子水平比较与非炎性疾病对照组比较，抗NMDAR脑炎组脑脊液CXCL13、CXCL10水平升高(均P<0.01)，脑脊液APRIL水平和血清CXCL10、BAFF水平下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；与炎性脱髓鞘疾病对照组比较，抗NMDAR脑炎组脑脊液CXCL10水平升高(P<0.05)，而脑脊液CXCL13、APRIL水平无统计学改变(均P>0.05)。3组间脑脊液BAFF水平比较无统计学差异(P>0.05)，血清及脑脊液IL-6水平比较亦无统计学差异(均P>0.05)。主要结果见图1。

注：脑炎组：抗NMDAR脑炎组，炎性对照组：炎性脱髓鞘疾病对照组，非炎性对照组：非炎性疾病对照组。CXCL13：CXC趋化因子13，CXCL10：CXC趋化因子10，APRIL：诱导增值配体，BAFF：B细胞活化因子，IL-6：白细胞介素6；图2、3，表2同。aP<0.05；bP<0.01

2.3 抗NMDAR脑炎患者不同病程细胞因子水平脑炎患者急性期时脑脊液CXCL13和IL-6水平高于缓解期(P=0.050，P=0.041)，且脑脊液和血清BAFF水平均高于缓解期(P=0.014，P=0.022)，而脑脊液和血清APRIL、CXCL10水平在急性期与缓解期间比较均无统计学差异(图2、3)。

图2 抗NMDAR脑炎患者不同病程脑脊液细胞因子水平比较(纵坐标取lg值)

图3 抗NMDAR脑炎患者不同病程血液细胞因子水平比较(纵坐标取lg值)

2.4 抗NMDAR脑炎脑脊液细胞因子水平影响因素Spearman相关分析显示，脑脊液CXLC13、CXCL10水平与年龄呈正相关(r=0.451，P=0.002；r=0.316，P=0.039)，与治疗与否呈负相关(r=-0.465，P=0.001；r=-0.409，P=0.007)，CXCL10水平与急性期最高mRS评分呈正相关(r=0.326，P=0.033)，CXCL13水平与性别相关(r=0.342，P=0.023)，脑脊液IL-6水平与淋巴细胞炎症相关(r=0.423，P=0.006)。结果见表2。

表2 抗NMDAR脑炎脑脊液细胞因子水平与临床特征的相关性分析

3 讨论

该研究结果显示，抗NMDAR患者脑脊液CXCL13、BAFF和IL-6水平在急性期高于缓解期，而血清仅BAFF水平在急性期高于缓解期。既往研究证实，CXCL13来源于基质细胞，主要在B细胞招募及分化中发挥作用[6]，是短寿命浆细胞(short-lived plasma cell，SLPC)招募中最主要的趋化因子。CXCL13在病毒性脑炎、眼球阵挛-肌阵挛综合征、脱髓鞘疾病如NMOSD和MS等神经系统疾病的脑脊液中均有所升高[7]。BAFF与APRIL均为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的B细胞标志物，在浆细胞归巢中发挥作用，与B细胞存活与分化成熟密切相关[8]，也有研究表明BAFF可促进骨髓中长寿命浆细胞(long-lived plasma cell，LLPC)存活[9]，APRIL可与IL-6共同维持骨髓中LLPC存活[10]。BAFF的过度表达可能破坏免疫耐受而诱发自身免疫疾病[8]。研究表明，BAFF在病毒性脑炎、NMOSD、狼疮脑病中可升高[11]。IL-6可由单核细胞、T/B细胞等多种细胞分泌，作用广泛，包括促进B细胞分泌免疫球蛋白，及T细胞成熟、分化等。在病毒性脑炎和急性播散性脑脊髓炎、NMOSD等脱髓鞘疾病患者的脑脊液中IL-6明显升高[7，12-14]；对于系统性红斑狼疮神经系统受累的患者，脑脊液IL-6的水平可以作为疾病活动性的标志物[15]。CXCL10是一类T细胞趋化因子，本身分泌受INF-γ等细胞因子的调节。Th1细胞在组织中可增强INF-γ和TNF-α，从而促进CXCL10的分泌；CXCL10又可招募更多Th1细胞，形成正反馈通路，使自身免疫过程得以持续。星形胶质细胞分泌的CXCL10也可以与记忆性B细胞结合，刺激B细胞在中枢神经系统分泌抗体[16]。Kothur等[7]系统性回顾了83项关于神经系统炎症性疾病的脑脊液细胞因子研究，发现 B细胞成熟相关的细胞因子如BAFF、APRIL、CXCL13等，在神经系统炎症性疾病中往往升高。Leypoldt等[17]研究提示CXCL13可能是抗NMDAR脑炎的活动性指标。Liba等[18]提出CXCL10与CXCL13一样在病程早期可明显升高，但在其后下降慢于CXCL13，而BAFF、INF-γ、TNF-α、IL-17、IL-7、IL-15随病程变化无明显改变。

该研究发现抗NMDAR脑炎患者脑脊液CXCL13、CXCL10水平较非炎性疾病对照组升高，而与炎性脱髓鞘疾病对照组无统计学差异，提示抗NMDAR脑炎可能与其他神经系统炎症性疾病具有相似的免疫机制。血清BAFF与CXCL10的水平在脑炎组反而较对照组更低。血清与脑脊液细胞因子水平变化的不同，可能是抗NMDAR脑炎鞘内合成致病抗体的另一佐证。相关性分析结果显示，患者年龄、是否接受过免疫治疗与脑脊液CXCL13、CXCL10水平相关。这与Leypoldt等[17]的研究结果一致。用于评价疾病严重程度的mRS评分与脑脊液CXCL10水平相关，脑脊液淋巴细胞炎症与IL-6水平密切相关，提示尽管B细胞相关的体液免疫是致病的主要机制，但T细胞在急性期炎症中亦发挥了重要作用。BAFF与APRIL水平在相关性分析中并不受年龄、性别、治疗等临床因素的影响，对病情的反应更为稳定。

综上所述，抗NMDAR脑炎患者脑脊液CXCL13、BAFF、IL-6及血清BAFF水平较缓解期升高，脑脊液CXCL10水平与病情严重程度相关，免疫治疗与脑脊液CXCL13、CXCL10水平呈负相关，提示抗NMDAR脑炎的病理机制可能是以鞘内体液免疫反应为主，伴有细胞免疫机制参与。由于该研究选择的细胞因子种类有限，缺乏针对脑脊液免疫细胞亚群的检测，尚不能全面揭示抗NMDAR脑炎的鞘内免疫机制；另外，该研究样本量较小，对照组匹配等方面存在不足，临床观察周期较短，缺少长期预后数据，因此有关抗NMDAR脑炎患者细胞因子与临床表现的确切关系尚需进一步研究。