99mTc-HYNIC-PTP的制备及其胰腺癌裸小鼠移植瘤模型SPECT显像研究

龚佳丽，赵凌舟，赵晋华

上海交通大学附属第一人民医院核医学科，上海 200080

胰腺癌是一种具有高度侵袭性和可快速致命的肿瘤，其患者5年生存率不到10%［1-2］。生存率低的一个重要原因是大多数（超过85%）患者早期症状不明显，确诊时已处于疾病晚期，失去了相应的手术机会。因此，胰腺癌的早期诊断能为患者带来更好的预后。目前，临床上没有可靠的血清标志物用于胰腺癌的早期诊断，而传统的影像学技术如计算机体层成像（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和超声在胰腺癌诊断和分期上仍不令人满意［3］。分子影像技术近年来蓬勃发展，能够在细胞和分子水平评估疾病发生、发展过程，实现疾病的早期精准诊断。研究表明，多种生物靶点有潜力用于胰腺癌诊断，包括间皮素［4］、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）［5］、黏蛋白1（mucin 1）［6］、胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）［7］、网蛋白（plectin）等。在这些靶点中，plectin在正常胰腺组织内低度表达，而在胰腺癌上皮细胞膜表面和细胞质内高表达，并且表达程度与胰腺癌的恶性程度呈正相关，是胰腺癌诊断和治疗的一个极具吸引力的靶点［8-9］。网蛋白靶向肽（plectin targeted peptide，PTP）是从噬菌体展示肽库中筛选出来的七肽，能与plectin靶向结合。因此，本研究选取PTP多肽为胰腺癌靶向分子，经过螯合剂肼基烟酰胺（hydrazino-nicotinamide，HYNIC）修饰后，进行放射性核素99mTc标记，获得靶向分子影像探针99mTc-HYNIC-PTP，在裸小鼠BxPC-3移植瘤模型中评估该探针用于胰腺癌单光子发射计算机断层成像（single photon emission computed tomography，SPECT）的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

H Y N I C-P T P多肽和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-PTP购自上海强耀生物科技有限公司，Na99mTcO4购自上海原子科兴药业有限公司，BxPC-3、PANC-1和β-TC-6细胞购自上海宏顺生物科技有限公司，RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰酶和磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate-buffered saline，PBS）及其他试剂购自上海迪奥生物科技有限公司，4～6周龄BALB/c雌性裸小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，薄层色谱仪购自美国Bioscan公司，SPECT仪购自美国GE公司（配以低能通用准直器）。

1.2 方法

1.2.199mTc-HYNIC-PTP的制备与体外稳定性评价

取50 μg HYNIC-PTP，加入0.5 mL乙二胺二乙酸溶液（20 mg/mL，含0.1 mol/L NaOH溶液）与0.5 mL 三（羟甲基）溶液（40 mg/mL，含0.2 mol/L PBS，pH=6.0）的混合液中，再加入2 5 μ L S n C l2溶液（1 mg/mL，含0.1 mol/L HCl）和50 mCi（1 mCi=3.7×107Bq）Na99mTcO4溶液，沸水浴中反应10 min。反应结束，自然冷却至室温，用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，快速薄层色谱（instant thin layer chromatography，ITLC）法测定标志物放射化学纯度。然后分别取100 μL标志物与900 μL PBS溶液（pH=7.4）室温下混合或900 μL FBS于37 °C混合，测定1、2、4和6 h放射化学纯度，评价体外稳定性。ITLC方法为溶液点样硅胶板，以50%乙腈为流动相展开。

1.2.2 细胞培养

配制含10% FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基与DMEM培养基。从液氮罐中取出冻存的BxPC-3、PANC-1和β-TC-6细胞，于37 °C水浴箱快速复温解冻，在超净工作台上将解冻的细胞悬液吸入离心管中，弃上清液，BxPC-3和PANC-1细胞加入RPMI-1640培养基重悬并移入培养皿中，β-TC-6细胞加入DMEM培养基。3种细胞于37 °C、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养；隔天换液，待细胞生长融合度达80%～90%，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化并传代。

1.2.3 BxPC-3皮下胰腺癌裸鼠模型建立

4～6周龄雌性BALB/c裸小鼠前肢皮下注射1×107个胰腺癌细胞（100 μL PBS溶液），在标准动物饲养房中饲养，待肿瘤直径达到0.8～1.0 cm时用于动物实验。

1.2.4 细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）细胞毒性试验

CCK-8细胞毒性试验评价HYNIC-PTP多肽体外对BxPC-3细胞的潜在毒性：取对数生长期的BxPC-3细胞接种于96孔板内，设置6个副孔，每孔加入8×103个细胞，于培养箱温育。24 h后，对照组加入完全培养基，实验组加入用培养基稀释的不同浓度（0～200 μg/mL）的HYNIC-PTP多肽，继续置于培养箱温育24 h。随后弃去培养基，每孔加入100 μL新鲜无血清培养基和10 μL CCK-8试剂，温育2 h后，96孔板置于酶联免疫仪内，检测每孔内吸光度（D）值（450 nm），计算细胞存活率。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测

采用Western blot比较PANC-1细胞、BxPC-3细胞和β-TC-6细胞plectin蛋白表达水平。取对数生长期的3种细胞，分别提取总蛋白，步骤如下：6%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，湿转转膜，室温封闭1 h，TBST洗3次，每次5 min。加入一抗（1∶1 000）4 °C过夜，TBST洗3次，每次10 min，二抗温育2 h，TBST洗3次，每次1 0 m i n，电化学发光（e l e c t r ochemiluminescence，ECL）法曝光，X线胶片曝光，显影，定影录条带，扫描胶片。

1.2.6 流式细胞术检测

采用流式细胞术检测FITC-PTP体外靶向结合BxPC-3细胞的能力：取对数期BxPC-3和PANC-1细胞，分别接种于6孔板内，2×105个/孔，贴壁24 h后换为无血清培养基，实验组加入12.5 μL FITC-PTP的PBS溶液（10 μmol/L），空白对照组加入同等体积的PBS，置于培养箱温育4 h。随后弃去培养基，消化离心细胞（1 000 r/min，3 min），再用PBS离心清洗2次（1 000 r/min，3 min），最后重悬细胞于200 μL的FACS缓冲液（PBS∶FBS=50∶1）中，上机检测。

1.2.7 SPECT显像

将皮下移植瘤裸小鼠麻醉后，尾静脉注射99mTc-HYNIC-PTP（200 μL，2 mCi）后，分别于注射后0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 h进行SPECT显像。

1.2.8 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行数据分析，采用独立样本t检验（Student’s t检验）进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 99mTc-HYNIC-PTP放射化学纯度及稳定性评价

从99mTc-HYNIC-PTP标志物的ITLC图谱（图1A）中可见，未标记的游离99mTc移到前沿，99mTc胶体在原点，99mTc-HYNIC-PTP在中间，说明50%乙腈展开体系能够有效地鉴别标志物和杂质。经计算后，99mTc-HYNIC-PTP放射化学纯度在99%以上（99.6%），无须进一步纯化；体外稳定性试验结果显示，99mTc-HYNIC-PTP在PBS和FBS中稳定性高（图1B），6 h内放射化学纯度无明显变化，表明标志物体外稳定性良好。

图1 99mTc胶体、99mTc-HYNIC-PTP和游离99mTc在50%乙腈展开体系中的ITLC图谱（A）及99mTc-HYNIC-PTP在PBS和FBS中不同时间点的放射化学纯度（B）

2.2 CCK-8细胞毒性试验

CCK-8试验结果（图2）显示，在HYNICPTP多肽浓度为0～200 μg/mL，BxPC-3细胞存活率均在90%以上，表明在给定的浓度范围内，HYNIC-PTP多肽具有良好的细胞相容性。

图2 CCK-8检测不同质量浓度HYNIC-PTP多肽对BxPC-3细胞存活率影响

2.3 Western blot检测

从Western blot图可知，BxPC-3细胞与PANC-1细胞中反映plectin表达的条带灰度都明显高于阴性对照细胞β-TC-6（图3），表明胰腺癌BxPC-3细胞内plectin的表达量远高于β-TC-6细胞（P＜0.001）。

图3 Western blot比较PANC-1细胞、BxPC-3细胞与β-TC-6细胞内plectin的蛋白表达量（A）及定量灰度值分析（B）

2.4 流式细胞术检测

研究［14］表明，PTP能与PANC-1细胞膜上的plectin靶向结合，因此，本研究在流式细胞术中以PANC-1作为阳性对照。结果（图4）显示，BxPC-3细胞与PANC-1细胞的相对荧光强度接近，相差很小，差异无统计学意义（P＞0.05），表明PTP多肽能够结合BxPC-3细胞，具有良好的靶向性。

图4 流式细胞术检测FITC-PTP与PANC-1细胞和BxPC-3细胞靶向能力比较

2.5 皮下胰腺癌移植瘤裸小鼠SPECT显像

SPECT图像显示，99mTc-HYNIC-PTP在肾脏和膀胱有持续的浓聚，提示显像剂主要通过泌尿系统排泄，而肝脏、脾脏、心脏及软组织等显影微弱，甲状腺区域未见放射性摄取。尾静脉注射0.5 h后，肿瘤部位即有显影，随后肿瘤摄取持续增加，周围组织放射性迅速减弱；2.0 h时肿瘤显像清晰，同时靶/非靶值（tumor/non-tumor，T/NT）最高（大约为3.9%ID/g），之后缓慢减弱，6.0 h仍有明显显影，表明99mTc-HYNIC-PTP在体内能够选择性聚集在肿瘤组织，并且有相对较长时间的滞留（图5）。

图5 皮下胰腺癌裸鼠尾静脉注射99mTc-HYNIC-PTP后不同时间点的SPECT显像（A）及不同时间点SPECT显像的T/NT值（B）

3 讨 论

正常的胰腺从癌前病变发展成浸润性癌要经历复杂的致癌过程。在约80%的胰腺癌患者中发现，胰腺的癌前病变为上皮内瘤变（pancreas intraepithelial neoplasia，PanIN），分为PanIN1A、PanIN1B、PanIN2和PanIN3。PanIN1和PanIN2几乎不会进展成胰腺癌，而PanIN3是胰腺癌变的一个重要前体［10］。因此，如果一种生物标志物能在PanIN3特异性表达，就能成为胰腺癌早期诊断与治疗的有效靶点。

Plectin是一种细胞骨架蛋白，相对分子质量为500 000，在哺乳动物的正常组织和细胞中有不同程度的表达［11-12］。Kelly等［8］通过蛋白质体外结合实验、Western blot和质谱分析，确定了plectin高表达于鼠源性和人源性胰腺癌细胞膜上和细胞质内，但在正常鼠源性胰腺导管细胞、人源性胰腺导管上皮细胞质内和细胞核内表达量不高。在后续的研究［9］中又发现plectin在上皮内瘤变Ⅰ～Ⅱ级时，表达量为0.00%～3.85%，但在上皮内瘤变Ⅲ级时，表达量增加到60%，而且在移植瘤小鼠模型的淋巴结和转移部位也发现plectin表达［13］。因此，plectin有潜力成为胰腺癌早期诊断、分期和预后监测的生物标志物。

PTP是从噬菌体展示肽库内筛选出来的7肽，能与plectin特异性结合。许多研究［14-15］证实，PTP多肽可作为靶向分子直接与显像基团连接或修饰在纳米材料表面构建靶向胰腺癌的分子探针，用于胰腺癌的显像。Wang等［14］设计了一种双靶向双模态分子探针（Gd-Cy7-PTP/RGD），修饰的PTP和RGD多肽分别靶向plectin和整联蛋白，钆（Gd）和荧光染料（Cy7）进行磁共振和荧光成像。Pal等［15］在PTP多肽的C端引入半胱氨酸和酪氨酸残基，以其为模板合成金纳米颗粒（GNPs），同时连接吉西他滨，制备了一种基于GNPs的靶向药物递送系统，在PANC-1原位移植瘤模型中具有优异的抗肿瘤功效。在核医学显像方面，目前仅有Bausch等［9］报道的111In标记四聚体PTP（tPTP）用于胰腺癌的SPECT/CT显像，然而111In核素目前国内供应困难，且半衰期较长，体内辐射量较大，不利于临床转化。因此，本研究利用放射性核素99mTc标记plectin靶向多肽PTP，制备了分子探针99mTc-HYNICPTP，用于胰腺癌的SPECT显像。相比于111In标记tPTP，99mTc-HYNIC-PTP具有易制备、合成简易和半衰期短等优势。

本研究利用双功能螯合剂HYNIC进行PTP标记99mTc，标记方法简单，放射化学纯度高（在99%以上），无须进一步纯化。在体外实验中，Western blot结果表明plectin在阴性对照细胞中低表达，在BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞中都高表达；在流式细胞术中，本研究选择已证实plectin高表达的PANC-1细胞作为阳性对照，结果表明，FITC-PTP在两种细胞中的荧光强度无明显差异，能有效地与BxPC-3细胞靶向结合。在体内显像研究中，皮下胰腺癌移植瘤裸小鼠SPECT结果显示，99mTc-HYNIC-PTP在肾脏和膀胱摄取最高，主要经肾脏排泄，其他器官如肝、脾、胃肠等摄取少；肿瘤摄取在注射显像剂0.5 h后即有明显显影，1.0～2.0 h后显像最为清晰，之后缓慢减弱，但6.0 h后仍显像清晰，表明99mTc-HYNICPTP具有良好的体内靶向性和滞留时间。上述研究结果表明，本研究制备的99mTc-HYNIC-PTP有潜力成为一种易于合成的胰腺癌靶向分子影像探针。