新疆祖卡木颗粒活性成分防治新型冠状病毒肺炎的整合药理学和网络药理学研究

吉米丽汗·司马依，买买提明·努尔买买提，季志红，艾尼瓦尔·吾买尔，紫若·塔里哈提，卡依赛尔·阿布都肉苏力，周文婷*

1新疆医科大学药学院；2新疆医科大学维吾尔医学院；3新奇康药业股份有限公司，乌鲁木齐 830011

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease in 2019，COVID-19)一种包膜RNA病毒引起的急性肺部感染。新型冠状病毒(原名2019-nCoV，现名SARS-CoV-2)主要侵犯呼吸系统，主要表现发热、干咳、乏力，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征(SARI)，脓毒症休克，甚至多器官衰竭等[1]。它与一组SARS样冠状病毒在致病机制和临床表现等方面也有较大的相似性[2]。SARS-CoV-2可与血管紧张素转化酶II(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合进入细胞造成感染。SARS-CoV-2进入宿主细胞后，释放RNA与细胞中核糖体集合，翻译出小核糖核酸病毒的3C蛋白酶(3CLpro)[3,4]。因此3CLpro与ACE2在SARS-CoV-2的致病过程中同样起到关键作用。然而至今仍缺乏有效抑制该病毒的临床药物。

根据2月1日新疆维吾尔自治区卫生健康委公布的《新型冠状病毒感染的肺炎中医(维吾尔医)治疗专家共识》推荐[5]，不少新疆地产药榜上有名。如属于湿热的血液质腐浊型患者，推荐酌情使用祖卡木颗粒(Zukamu granule，ZKMG)。ZKMG由山奈、睡莲花、薄荷、大枣、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黄和罂粟壳等10味中药组成，具有较好的抗流感病毒、抗菌作用和抗炎作用[6]。

中医药整合药理学研究平台(integrative pharmacology-based research platform of traditional chinese medicine，TCMIP)V2.0以中医药百科全书在线数据库(ETCM)为数据资源，包含疾病相关分子集及其功能挖掘、证候相关分子挖掘及功能分析、中药药性相关分子挖掘及功能分析、中药(含方剂)靶标预测及功能分析、组方用药规律分析、中医药关联网络挖掘、反向查找中药(含方剂)等七大功能模块[7]。网络药理学是一门以系统生物学，计算机生物学以及多向药理学为融合的新兴学科。可以从多层面网络稳定的角度探究药物与疾病之间相互作用机理。本研究借助中医药整合药理学、网络药理学和分子对接，通过综合分析祖卡木颗粒的活性成分，并通过分子对接技术对ZKMG的活性成分与3CLpro和ACE2进行分子对接，探讨ZKMG对COVID-19作用的物质基础，为其临床应用提供一定的参考和依据。

1 数据库及方法

1.1 ZKMG化学成分来源

基于TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)的中药数据库，收集山奈、睡莲花、薄荷、大枣、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黄和罂粟壳等中药所含化学成分，并结合TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID数据库(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)的“herb”中输入ZKMG的10味中药，并获取化学成分。

1.2 候选成分的筛选

运用TCMIP V2.0的中药成分数据库，以“1.1”所得到的成分英文名为限定词进行检索，获取其吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET)水平，数值含义0表示“good”,1表示“moderate”，2表示“low”，3表示“very low”。并结合TCMSP数据库的中药动学参数口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-like，DL)≥0.18为筛选标准对ZKMG的10中药的化学成分进行筛选[8]。

1.3 ZKMG候选成分配体的前处理

借助ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)下载“1.2”所得的候选成分3D结构的mol格式文件。在PyMol软件(https://pymol.org/)中检查空间结构无误后，以pdb格式保存。将结构件载入AutoDock Tools 1.5.6程序，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转。保存为pdbqt格式，作为对接配体。

1.4 3CLpro和ACE2受体的前处理

采用AutoTools对3CLpro(PDBID：6LU7)和ACE2(PDBID：1R42)晶体结构蛋白进行预处理，删除多余的蛋白链和配体、加氢去除水分子，计算Gasteiger电荷，保存为pdbqt文件，作为用于做分子对接的受体。

1.5 分子对接

以“1.3和1.4”项下得到的配体和受体使用Autodock Vina(版本：1.2，http://vina.scripps.edu/index.html)进行对接。最后取优势构象进行分析，并用Schrodinger(https://www.schrodinger.com)作图。

1.6 ZKMG活性成分及其核心靶标的筛选

以“1.5”项下得到的与3CLpro和ACE2具有较高结合能的成分作为活性成分。通过TCMIP V2.0中药成分数据库以活性成分英文名为关键词检索其靶标。按照MACCS(molecular ACCess system)分子指纹特征提取方法和Tanimoto系数定义的相似度计量方法，针对中药化学成分和FDA上市药物进行相似性打分，打分分数score≥0.8则为相似性药物，并进行核心靶标的提取。

1.7 基因富集分析

为了系统阐明ZKMG治疗COVID-19的作用，“1.6”项下得到的核心靶标进行GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集分析。并通过Cytoscape 3.7.1软件(版本：3.7.1，https://cytoscape.org)构建中药-活性成分-核心靶标-关键通路网络图。

2 结果

2.1 ZKMG化学成分收集及候选成分的筛选

ZKMG的10味中药通过TCMIP V2.0的中药数据库只检索到薄荷的28个、甘草的133个、罂粟壳的14个、大黄的88个、大枣的64个化学成分。在TCMSP数据库检索到薄荷的164个、大枣的133个、甘草的280个、大黄的92个和罂粟壳的24个。在TCMID数据库检索到山奈的24个、薄荷的74个、大枣的153个、甘草的172个、大黄的101个和罂粟壳的32个成分。在BATMAN-TCM数据库检索到薄荷的26个、大黄的58个、甘草的172个、大枣的49个、罂粟壳的27个和山奈的13个。ZKMG的10味中药中破布木果、蜀葵子、睡莲花和洋甘菊等中药在4大数据库中未被检索到。为了避免个别认可度较高的有效成分未筛选出来，故同时查阅中国药典(2015版)和CNKI文献的相关成分，得到此类成分并合并至4大数据库筛选结果中。其中破布木果16个、蜀葵子8个、睡莲花6个和洋甘菊18个化学成分[9-13]。以上化学成分按照TCMIP V2.0数据库的ADMET吸收水平等于0和1，以及TCMSP数据库的OB≥30%和DL≥0.18筛选标准，并删除重复的成分后得到48个候选成分(见表1)。

表1 ZKMG通过ADMET筛选的候选成分Table 1 Candidate compounds from ZKMG screened by ADMET

续表1(Continued Tab.1)

2.2 分子对接分析结果

将48个候选成分在通过ZINC数据库以mol格式保存、在PyMol软件以pdb格式保存、在AutoDock Tools 1.5.6程序以为pdbqt格式保存。以ZKMG的48个候选成分作为配体，以3CLpro和ACE2蛋白为受体，根据蛋白复合物中配体的坐标以及蛋白活性口袋进行设置，配体设置为柔性，受体刚性(图1)。按照结合能来判断候选成分与靶点的匹配度，一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大[14]。为了提高筛选标准，将48个候选成分的最优结合能与目前临床推荐化学药物，即洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)和瑞德西韦(remdesivir)等药物进行对比。结果表明，瑞德西韦最优结合能在3个临床推荐化学药物中最低，为-4.9 kJ/mol，于是收集最优结合能小于该药物的活性成分得到16个候选成分，部分结果见表2。结果可以看出来，活性成分与2019-nCoV-Mpro结合模式中可以看出来，氢键和π-π相互作用对小分子与蛋白的识别和稳定性起着关键作用。

图1 2019-nCoV-Mpro与原配体的三维结构图Fig.1 Three dimensional structure of 2019-nCoV-Mpro and original ligand

表2 ZKMG候选成分与作用于COVID-19靶点的分子对接Table 2 Molecular docking between ZKMG candidate components and COVID-19 targets (binding energy≤-4.9 kJ/mol)

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

2.3 核心靶标的筛选

以上得到的16个活性成分通过TCMIP V2.0中药靶标数据库以score≥0.8为标准进行筛选。其中gancaonin B、licoisoflavone B、glycyrol、lupiwighteone、glyzaglabrin、medicarpin等6个活性成分没有预测打分分数score≥0.8的核心靶标。其他10个活性成分有465个核心靶标，去重复得到91个核心靶标。

2.4 基因富集分析结果

利用R语言(cluster profile包)对筛选的91个核心靶标进行GO富集分析及KEGG信号通路富集分析。其中GO富集分析中共得到BP为133个，CC为31种，MF为62种。根据校正后P值进行排序，选择前各10个基因进行图形显示，见图2。KEGG通路富集分析筛选得到53条信号通路，根据校正后P值进行排序，选择前15个基因进行图形展示(见图3)。

图2 ZKMG治疗COVID-19核心靶标的GO基因功能富集分析Fig.2 Functional enrichment analysis of GO gene in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

图3 ZKMG治疗COVID-19核心靶标的KEGG信号通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of hub target in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

2.5 中药-活性成分-核心靶标-关键通路多维网络分析

为了系统的阐明ZKMG对COVID-19的作用，构建中药-活性成分-核心靶标-关键通路多维网络，见图4。ZKMG的10味中药中罂粟壳不包含10个活性成分。其余9味中药中来自于甘草的5个活性成分、来自于洋甘菊和薄荷的各3个活性成分、来自于山奈，蜀葵子和睡莲花的各2个活性成分以及自于大黄和大枣的各1个活性成分。中药-活性成分-核心靶标-关键通路多维网络包括9味中药、10个活性成分、91个核心靶标以及15个关键通路。活性成分通过联合调控细胞色素P450超家族(CYP1A2、CYP19A1、CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP3A5、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6)参与药物代谢-细胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)和细胞色素P450对外源物质代谢的影响(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)，γ-氨基丁酸受体家族(GABRA2、GABRG1、GABRA3、GABRA1、GABRG2、GABRA4、GABRA6、GABRA5、GABRG3)参与γ-氨基丁酸能突触(GABAergic synapse)和神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)以及PIK3CG、AKT1和CDK6同时参加非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)和小细胞肺癌(small cell lung cancer)。

图4 ZKMG治疗COVID-19的“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”多维网络关系Fig.4 The multidimensional network relationship of “TCM-chemical compound-hub target-key pathway” of ZKMG for treatment COVID-19

3 讨论

TCMIP V2.0是有利于克服中药现代研究中“化学成分体内过程-药理活性-病征效应”之间“碎片化”现象，形成中药特色的药理学评价体系和研究方法。本文通过中医药整合药理学平台和网络药理学结合发现，ZKMG的16个活性成分与2019-nCoV-Mpro和ACE2最优结合能小于符合临床推荐化学药物。按照MACCS分子指纹特征提取方法和Tanimoto系数定义的相似度计量方法，16个活性成分与FDA上市药物进行相似性打分，结果表明，其中木犀草素、毛纲草酚、大黄酸、芒丙花素、山奈甲黄素、半甘草异黄酮B、异鼠李素、洋芫荽黄素、山奈酚和槲皮素等10个活性成分满足score≥0.8的要求。其中木犀草素(luteolin)通过其抗炎和抗氧化活性抑制脓毒症诱导的脓毒症诱导的急性肺损伤[15]。大黄酸(rhein)通过改善肺部微血管屏障，从而有效改善油酸所致急性肺损伤大鼠肺部炎症及水肿[16]。芒柄花黄素(formononetin)诱导肺癌细胞A549凋亡，抑制其生长[17]。Kaempferide通过降低Akt和claudin-2表达，增强人肺腺癌A549细胞的化疗敏感性[18]。香叶木素(diosmetin)通过降低动脉氧合指数及炎性因子表达水平,对胎粪诱导的新生大鼠急性肺损伤具有一定的治疗作用[19]。感染SARS-CoV-2病毒的患者有大量的INF-γ、MCP-1、IP-10和IL-Iβ[21]。SARS-CoV-2病毒感染导致了抑制炎症的IL-4和IL-10的分泌增加[22]。槲皮素(quercetin)会下调IL-6、IL-1β和TNF以及上调IL-10而发挥抗炎作用[22]。而山柰酚(kaempferol)通过减轻氧化应激以及显著降低支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子，抑制NF-κB信号通路，从而对病毒诱导的急性肺损伤小鼠产生保护作用[23]。以上都是对新疆祖卡木颗粒活性成分防治COVID-19的预测结果提供佐证。其中圣草酚(eriodictyol)、半甘草异黄酮B(semilicoisoflavone B)和异鼠李素(isorhamnetin)等成分的研究报道较少，需要进一步研究。

中药-活性成分-核心靶标-关键通路多维网络分析结果表明，ZKMG中存在一个活性成分与多个核心靶标作用，同时也存在不同活性成分用于同一个核心靶标的现象，这体现了中药多成分与多靶标之间共同作用的机制。KEGG通路分析得出，PIK3CG、AKT1和CDK6等核心靶标同时参加神经系统、内分泌和免疫应答相关的信号通路以及肺部最为相关的小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

综上所述，木犀草素、毛纲草酚、大黄酸、芒丙花素、山奈甲黄素、半甘草异黄酮B、异鼠李素、洋芫荽黄素、山奈酚和槲皮素等10个活性成分可能通过与3C类似蛋白酶结合作用于多靶点、多通路的协同作用来发挥疗效的，从而起到辅助治疗COVID-19 的作用。鉴于整合药理学和分子对接的局限性，需要开展实验研究，为ZKMG治疗COVID-19以及后期的药物开发提供理论和实验依据。