基于网络药理学和分子对接探讨金钱草治疗痛风的作用机制

王佰灵，罗 伦，戈振凯，邱婧然，王 源，黄婉君，郝新才,3，赵永恒,3*

1湖北医药学院药学院；2武当特色中药研究湖北省重点实验室；3湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心，十堰442000

痛风是由尿酸排泄障碍和(或)嘌呤代谢紊乱而引起的血尿酸增高的代谢性疾病[1]。痛风常引起关节的疼痛、畸形和肾脏损害，多并发于高血压、糖尿病和心血管等疾病。因饮食结构改变，痛风患病率呈现逐年增加趋势，且发病率与年龄呈正相关，80岁以上痛风发病率高达12%。西医治疗痛风常采用尿酸生成抑制药物(如别嘌醇)、尿酸排泄促进药物(如来辛奴拉、曲尼司特等)、抗炎药物(非甾体抗炎药、秋水仙碱)以及皮质激素类等进行治疗，是以纠正高尿酸血症，防止痛风发作为目的。但由于不良反应明显，需长期服药，导致患者顺应性差，使其应用受到限制。

中医药治疗痛风具有多靶点、疗效好、安全性高等特点，在降低尿酸水平、抗炎等方面具有西医无法代替的优势。痛风，属中医“痹证”范畴，又称之为“白虎历节”、“湿病”等。金钱草具有利湿退黄，利尿通淋等功效，用于湿热黄疸，石淋，热淋，小便涩痛等证[2]。金钱草复方能够明显改善痛风患者的症状，在临床上取得了较好的疗效[3]。现代药理研究表明，金钱草可使高尿酸血症小鼠血清尿酸水平下降[4]。金钱草总黄酮可使血清肌酐、尿素氮水平以及小鼠肾脏指数降低，黄嘌呤氧化酶以及腺苷脱氨酶的活性减弱，降低血清TNF-α、COX-2、MCP-1水平，改善肾脏病变以及恢复胸腺、脾脏免疫器官的萎缩[5]。目前对于金钱草治疗痛风的药效成分及作用机制尚缺乏系统认识。因此，本研究借助网络药理学的方法从整体上探讨金钱草治疗痛风的潜在药效成分、作用靶点及信号通路，为金钱草的进一步研究及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 金钱草活性成分及靶点的收集

以“金钱草”、“Jin Qian Cao”、“Christina Loosestrife”或“Herba Glechomae Longitubae”为检索词，检索TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID数据库(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)、ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/)、Sym-Map数据库(https://www.symmap.org/search/)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，并在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)、中国知网、万方数据库进行文献挖掘，获取金钱草化学成分。

以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-like，DL)≥0.18作为筛选条件，从而得到活性成分。活性成分的作用靶点从TCMSP 数据库中获得，把靶点名称输入UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)，获得相应的人源靶点基因名称。

1.2 痛风相关靶点的收集

以“gout”、“hyperuricemia”、“chronic gout”、“chronic gouty arthritis”、“gout acute”或“primary gout”为检索词，在GeneCards(https://www.genecards.org)、Therapeutic Target Database(TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://www.omim.org)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/search)数据库中，检索痛风潜在靶点信息。利用UniProt数据库，设定物种为“Homo sapiens”，对靶点命名进行规范化处理，得到官方名称。

1.3 潜在作用靶点的预测

分别将金钱草活性成分的相关靶点及痛风相关靶点，输入韦恩图在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，获取两者交集，即为金钱草治疗痛风的潜在作用靶点。

1.4 “活性成分-预测靶点”网络的构建

将活性成分和潜在作用靶点导入Cystoscope 3.7.2软件进行“活性成分-预测靶点”网络构建、分析和可视化。

1.5 蛋白互作网络(PPI)的构建

将交集靶点输入到STRING 11.0数据库中构建蛋白互作网络。设定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阀值设为高置信度0.7，简化显示设置为“hide disconnected nodes in the network”，其余参数保持默认，获得蛋白互作关系，并导出蛋白相互作用关系的TSV格式的数据文件。选取文件中的node1、node2和Combined score三列导入到Cytoscape3.7.2中，利用“NetworkAnalyzer”工具，设置节点颜色与大小反映Degree值大小，边的粗细反应Combined score的高低，构建PPI图。

1.6 分子对接

利用Vina软件对主要活性成分及核心靶点进行分子对接，以评价网络分析预测的可靠性。首先，准备配体和受体：使用ChemBioDraw 3D软件绘制活性成分的三维结构，并以mol2格式保存，使用AutoDock TOOLs保存为pdbqt格式。从RCSB蛋白质数据库(PDB)(http://www.rcsb.org/)下载关键靶点的晶体结构，用PyMOL软件删除配体，并用AutoDock TOOLs进行加氢和除水等修饰，保存为pdbqt格式。其次，准备对接和评分参数，包括网格参数文件，地图文件，对接参数文件。最后，利用Vina软件进行分子对接。

1.7 靶点的基因本体(GO)分析和通路注释

利用RStudio软件中CludterProfiler包进行GO富集分析和KEGG代谢通路分析，并选取P-value排名靠前的分析结果以图的形式展示。

2 结果

2.1 金钱草治疗痛风的活性成分及靶点的获取

从数据库中共检索到金钱草相关成分356个。根据DL≥0.18和OB≥30%的条件筛选，获取每个活性成分所涉及的潜在靶点，通过UniProt数据库比对校正后去重，共获得共获得15个活性成分(见表1)和190个潜在靶点。

表1 金钱草治疗痛风潜在成分Table 1 Potential active components in the treatment of gout in Lysimachiae Herba

图1 疾病靶点与活性成分靶点交集的韦恩图Fig.1 Venn diagram of active components-disease intersecting targets

2.2 痛风相关靶点的收集

以“gout”、“hyperuricemia”、“chronic gout”、“chronic gouty arthritis”、“gout acute”或“primary gout”为检索词，分别从Genecards、TTD、DisGeNET和OMIM中检索到1 457、17、693和384个与痛风相关靶点，去除重复的，共有2 236个。将金钱草活性成分的190个靶点与痛风的2 236个靶点取交集后，共获得99个交集靶点。

2.3 “活性成分-预测靶点”网络的构建

将活性成分和相应靶点导入Cystoscope 3.7.2软件即得到“活性成分-预测靶点”网络图(图2)，其中每条边代表活性成分与作用靶点之间的关系，椭圆形代表靶点、V形代表药物成分。在网络图中，共包含114个节点，其中化合物节点15个，靶点节点99个。相互作用的边432条，靶点与成分的平均度值为3.79。其中，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、异鼠李素(isorhamnetin)、金合欢素(acacetin)、金圣草(黄)素(chryseriol)、甘草素(liquiritigenin)、圣草酚(eriodictyol)、柽柳黄素(quercetin 4′-methyl ether)等的度值较高，均能与4个以上的靶点相连接，推测这10个成分可能是金钱草发挥治疗痛风作用的主要活性成分，体现了金钱草治疗痛风是通过协调多成分、多靶点发挥作用的。

图2 活性成分-预测靶点相互作用网络Fig.2 The diagram of active components-targets

2.4 蛋白互作网络(PPI)的构建

将筛选得到的99个共同靶点导入到STRING 11.0数据库并利用Cystoscope 3.7.2软件构建PPI图(图3)。图中圆形节点表示不同的基因蛋白，节点连线表示蛋白之间的作用关系。圆形节点的颜色和大小表示degree值的大小，节点越大表示degree值越大，颜色由橙变绿则相应的degree值则由大变小，节点连线的粗细表示combine score，边越粗，combine score越高。IL6、AKT1、MAPK8、IL1B、JUN、MAPK1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、EGF、MMP9、RELA、CCL2、MYC、ICAM1、MAPK3、IL10、CASP3、STAT1、MAPK14、FOS、HMOX1、CCND1、MMP2、IL2、IL4、APP、PPARG、VCAM1、ESR1、NOS3、CRP、AR、BCL2L1、NFKBIA、CASP8、IFNG、 SERPINE1、IL1A的Degree值均大于中位数16，对金钱草治疗痛风具有重要意义，认为其为主要靶点。其中靶点IL6、AKT1、MAPK8、IL1B、JUN、MAPK1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、EGF、MMP9、RELA、CCL2的Degree值大于中位数的2倍，表明这些靶点为金钱草治疗痛风的核心靶点。

图3 金钱草治疗痛风潜在作用靶点相互作用网络图Fig.3 The PPI network of potential targets related gout of Lysimachiae Herba

2.5 分子对接

PPI中具有较高Degree值的节点，被认为是核心靶点。将“2.4项下”筛选出的13个核心靶点与金钱草中10个主要活性成分进行分子对接验证，对接结果见表2，其热图见图4。对分子对接来讲，结合能(affinity)越小，表示配体与受体结合的越牢固，结合能低于-5.0 kcal/mol表明具有良好的结合活性。结果显示，主要活性成分与核心靶点的结合能介于-5.2 kcal/mol与-9.9 kcal/mol之间，表明金钱草主要活性成分与核心靶点具有较好的结合活性，预测结果较为可靠。

图4 分子对接能量热图Fig.4 Molecular docking heat-map

表2 主要活性成分与核心靶点的分子对接结果Table 2 Molecular docking results of active components and core targets

为明确靶点蛋白与所对应成分之间的结合活性，本研究选取4个对接能量较小的结果进行展示。其对接模式见图5，结果表明，quercetin与PTGS2中的ARG-377、ASN-376、VAL-229、ASN-538、TYR-374和GLN-374等6个残基结合；luteolin与PTGS2中的ARG-377、ASN-376、VAL-229、ASN-538和GLN-374等5个残基结合；quercetin 4′-methyl ether与PTGS2中的CYS-36、GLN-136、TYR-131、GLY-45和GLU-466等5个残基结合；eriodictyol与PTGS2中的ASP-125、CYS-47、ARG-44和ARG-469等4个残基结合，均具有良好的结合位点。

图5 金钱草部分活性成分与核心靶点的对接模式图Fig.5 Molecular docking models of active components acting on core targets of Lysimachiae Herba

2.6 基因本体(GO)分析和通路注释

根据P<0.05进行GO富集分析，选取P-value排名前15的分析结果进行展示(图6)。其中，生物过程(biological process)共富集到1 999条，占91.24%，为主要过程，主要涉及有毒物质的反应、氧化应激反应、细胞外刺激反应、细菌起源分子反应、营养水平的反应等。分子功能(molecular function)共富集到137条，占6.25%，主要涉及细胞因子受体结合、蛋白质异二聚活性、受体调节活性、辅因子结合、受体配体活性等。细胞组分(cellular component)共富集到55条，占2.51%，主要涉及膜筏、膜微区、膜区、核染色体部分等。体现了金钱草可能通过调控多个GO功能来治疗痛风。

图6 金钱草潜在作用靶点的GO功能富集分析(P<0.05)Fig.6 The bar and pie diagram of GO enrichment of Lysimachiae Herba(P<0.05)

根据P<0.01进行KEGG通路富集分析，共富集到133条通路。选取P-value 排名前20的通路进行做图(图7)。图中，节点越大代表富集到的靶点数量越多，节点的颜色越红代表P-value越大。因此红色节点越大，该信号通路越重要。其中，TNF信号通路等属于信号传导通路；糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎等属于人类疾病通路；IL-17信号通路等属于免疫系统通路。以上KEGG富集分析结果表明金钱草是通过调节不同类型的通路发挥治疗痛风作用的。

图7 金钱草潜在作用靶点的KEGG通路富集分析(P<0.01)Fig.7 Enriched bubble diagram of KEGG signaling pathway of potential targets of Lysimachiae Herba(P<0.01)

3 讨论

从“活性成分-预测靶点”网络中可知，槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、异鼠李素、金合欢素、金圣草(黄)素、甘草素、圣草酚、柽柳黄素可能为金钱草治疗痛风的主要活性成分。研究表明：黄酮类成分可能为金钱草抗痛风活性组分，其中槲皮素可使黄嘌呤氧化酶(XO)的活性降低[8]，并使肝脏和肠道中葡萄糖转运蛋白9的表达减少，从而使高尿酸血症小鼠的血清尿酸(UA)、尿素氮和肌酐水平下降[9]；山奈酚可显著抑制XO活性，其机制可能为山奈酚插入XO活性中心位点，竞争性抑制底物的进入，进而减少XO催化黄嘌呤生成尿酸[10]；异鼠李素可直接抑制肝脏中XO活性，从而抑制UA的产生[11]；木犀草素能通过下调IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6的水平，以达到缓解急性痛风性关节炎模型大鼠的踝关节肿胀[12]。PPI网络分析表明，金钱草可通过降低由于尿酸盐沉积诱发的IL6、IL1B、CXCL8、CCL2等炎症因子和趋化因子的表达和水平，可以控制炎症，进而改善痛风症状[13]。金钱草中主要活性成分通过抑尿酸生成、促进尿酸排泄和改善炎症方面发挥治疗痛风的作用。

KEGG通路富集分析表明，金钱草治疗痛风的通路主要涉及TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎、IL-17信号通路等。IL-17是一种主要由辅助性T细胞及先天性免疫细胞等分泌的促炎性细胞因子，在炎症性疾病和自身免疫性疾病中发挥重要作用[14]。关节内注射尿酸单钠晶体可刺激Th17细胞和Th17相关的炎症细胞趋化因子IL-17的产生。IL-17中和抗体能显著降低白细胞浸润和髓过氧化物酶活性，降低IL-1α、IL-1β、IL-16、IL-17的表达，从而减轻炎症反应[15]。IL-17受体通过激活下游NF-κB、JNK等信号通路，进而抑制其他炎症介质的释放，发挥显著的抗炎作用，缓解痛风症状。TNF主要由巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等细胞产生，可诱导白细胞内皮活化、细胞因子和化学因子扩增，并促进蛋白水解酶和氧自由基的释放，促进炎症发生、发展[16]。研究发现，痛风患者的血清TNF-α水平升高[17]，TNF的阻断显著降低了IL-1、IL-6、IL-8或GMCSF等促炎细胞因子和趋化因子。TNF作为前炎因子，通过诱导IL-1活化、增强IL-6介导的炎症反应以及激活NF-κB炎症信号通路，诱发痛风性关节炎的病理过程，TNF-α拮抗剂在痛风的治疗中具有重要作用[18]；在TNF信号通路中，TNF-α可以使NF-κB等上调，而引起多种效应因子增加，达到白细胞募集、炎症级联放大等效应，以控制炎症反应[19]。尿酸盐结晶作为一种内源性危险信号相关分子被细胞膜表面和Toll样受体等识别，激活NF-κB，诱导炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-β等)的释放，促进痛风性炎症发作。研究表明，通过抑制TLR2、TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表达，可减少血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的合成与释放[20]。

本研究借助网络药理学的方法，预测金钱草治疗痛风的活性成分、靶点及其分子机制，结果表明金钱草通过多成分、多靶点以及多通路协同发挥治疗痛风的作用。但后续还需进行生物学实验，对活性成分、核心靶点进行验证，以明确金钱草治疗痛风的机制。