一测多评法测定不同产地巴戟天中4种环烯醚萜含量

王丽丽，崔庆艳，张素中，王永生，王诗涵

1中山大学新华学院 药学院，广州 510520；2吉林大学 药学院，长春 130021；3吉林农业大学 中药材学院，长春 130118

巴戟天来源于茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天(MorindaofficinalisHow.)的干燥根[1]，该中药材始载于《神农本草经》，列为上品，历代本草都有记载，是著名的保健中药材，也是我国“四大南药”之一，以广东为道地产区，具有抗骨质疏松、补肾阳、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、增强机体免疫力等作用[2,3]。巴戟天中主要成分有环烯醚萜类、蒽醌类、糖类及有机酸类等[3,4]。以水晶兰苷为代表的环烯醚萜类成分具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗肥胖等作用[4-8]。车叶草苷还具有骨保护作用和降低急性肺损伤的作用[9]。

近年来，随着人们的意识以医疗为重点转向以预防保健为重点，巴戟天的需求量不断提升，逐渐出现了以次充好的现象。《中国药典》2015年版巴戟天含量测定项选用耐斯糖一种成分作为定量指标[1]，存在一定的局限性，若能将多个指标性成分同时纳入定量指标，将对巴戟天的品质会有更全面的评估。

一测多评法是利用中药材有效成分之间的内在函数和比例关系，通过测定一种成分(对照品易于获得)而实现多种成分(对照品难以获得或价格昂贵)的同步测定，该方法是《中国药典》2015版重点推广的方法，现已成为中药材多指标成分含量测定的首选方法[10]。但当前国内外尚无采用一测多评法测定其含量的报道。

本实验建立一测多评法，首次实现对巴戟天中4种环烯醚萜类成分水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷的同步测定，并对不同产地巴戟天进行质量控制，为其质量标准修订提供参考。

1 仪器和试药

Agilent 1260 型液相色谱仪(安捷伦公司)；Waters Alliance E2695型液相色谱仪(沃特世公司)；LC-10ATVP型岛津液相色谱仪(产地：日本)；色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Sartorious型十万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；WP-UP-Ⅲ-10型超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)。

水晶兰苷(批号：5945-50-6，成都埃法生物科技有限公司)；去乙酰基车叶草苷酸(批号：14259-55-3，成都埃法生物科技有限公司)；车叶草苷酸(批号：25368-11-0，成都埃法生物科技有限公司)；车叶草苷(批号：14259-45-1，成都埃法生物科技有限公司)；11批巴戟天样品来源信息见表1，经吉林大学王广树教授鉴定，为茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天(MorindaofficinalisHow.)的干燥根；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；水为超纯水(自制)；其余试剂均为分析纯。

表1 11批巴戟天样品来源信息Table 1 Eleven batches of M.officinalis source information

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液+0.01 mol/L磷酸氢二钾缓冲盐(B)，梯度洗脱(0～12 min，1% A；12～30 min，1%A→17% A；30～40 min，17% A)；流速为1.0 mL/min；检测波长为235 nm；柱温为25 ℃；进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸和车叶草苷对照品适量，制成质量浓度分别为2.540 0、0.840 0、5.025 0×10-2、2.028 0×10-2mg/mL的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，制成质量浓度依次为0.635 0、0.210 0、1.256 2×10-2、5.070 0×10-3mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取巴戟天药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80% 的甲醇，超声提取30 min(功率为400 W，频率为90 Hz)，过滤，滤渣再同法提取一次，合并提取液，水浴蒸干，用初始流动相溶解。过滤，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，混合对照品溶液与供试品溶液在相同时间处均有相应的色谱峰出现，各色谱峰分离较好，分离度均大于1.5；空白溶剂在相应保留时间处没有色谱峰出现，对测定无干扰；理论塔板数以所测目标成分计均大于8 000(见图1)。

图1 混合对照品溶液(A)和样品(B)HPLC图谱Fig.1 HPLC of reference substances(A)and samples(B)注：1：水晶兰苷；2：去乙酰基车叶草苷酸；3：车叶草苷酸；4：车叶草苷。Note:1:Monotropein;2:Deacetyl asperulosidic acid;3:Asperulosidic acid;4:Asperuloside.

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液1.25、2.50、3.75、5.00、7.50 mL，置于20 mL量瓶中，加入初始流动相定容。按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以4种成分的质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

表2 4种环烯醚萜成分的线性关系考察Table 2 Investigation on the linear relationship of four kinds of iridoids

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷峰面积的RSD分别为0.17%、0.08%、0.36%、0.47%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷峰面积的RSD值分别为0.97%、0.43%、0.94%、1.31%(n=6)，表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批巴戟天药材粉末，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按ESM法计算4种成分的含量。结果，水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷的平均含量分别为12.02、3.85、0.12、0.08 mg/g，RSD分别为0.74%、0.80%、1.08%、1.34%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批巴戟天药材粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，按样品含量-对照品约(1∶1)的比例加入一定量对照品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果，水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷的回收率分别为100.03%、99.97%、99.35%、99.68%，RSD分别为0.32%、1.05%、0.93%、1.01%(n=6)，表明该方法的准确度较好。

2.9 相对校正因子的测定

取“2.2.1”项下混合对照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以去乙酰基车叶草苷酸(Ⅱ)为内参物，根据公式按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[11]，式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为其他组分m的峰面积，Wm为其他组分的质量或浓度。以去乙酰基车叶草苷酸(Ⅱ)为内参物，分别计算水晶兰苷(Ⅰ)、车叶草苷酸(Ⅲ)、车叶草苷(Ⅳ)的相对校正因子(见表3)。

表3 巴戟天中3种环烯醚萜类成分相对校正因子Table 3 Relative correction factors of three iridoids in M.officinalis

2.9.1 不同仪器及色谱柱对相对校正因子的影响

考察三种不同型号仪器Agilent 1260、Waters E2695、LC-10ATVP液相色谱仪和两种不同色谱柱Venusil MP C18和Agilent ZORBAX SB-Aq(均为250 mm×4.6 mm，5 μm)对相对校正因子的影响，分别计算各成分的相对校正因子及RSD值。结果表明，使用不同仪器和色谱柱，各成分相对校正因子的RSD值均小于2.00%(见表4)。

表4 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响Table 4 Effect of different instruments and columns on relative correction factors

2.9.2 不同实验人员对相对校正因子的影响

考察了3名实验人员对各成分相对校正因子的影响，各成分相对校正因子的RSD值均小于2.00%(见表5)。

表5 不同实验人员对相对校正因子的影响Table 5 Effect of different experimenter on relative correction factors

2.9.3 待测成分色谱峰的定位

采用相对保留时间定位法，考察其在3个高效液相色谱色谱仪、2个不同色谱柱上各待测组分色谱峰的相对保留时间(t)和重现性。结果表明，在相同的色谱条件下，各成分相对保留时间在不同仪器和色谱柱条件下变化较小，RSD值均小于4.00%(见表6)。

表6 不同仪器和色谱柱对相对保留时间的影响Table 6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.10 样品含量测定

取11批不同产地巴戟天样品，按“2.2.2”项下方法制备巴戟天样品溶液，每个产地的药材平行制备2份样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别用外标法(ESM)和一测多评法(QAMS)计算各成分的含量，并将两种方法的含量测定结果进行比较，结果显示相对标准偏差(RSD)均小于2.00%，表明外标法与一测多评法测定结果之间无明显差异，说明本实验所建立的同时测定巴戟天中4种成分的一测多评法准确性良好(见表7)。

表7 不同产地巴戟天4种环烯醚萜测定结果Table 7 Determination of four iridoids in M.officinalis in different areas

3 讨论

本实验考察了提取溶剂(70%、80%、90%甲醇)、不同提取方法(超声提取法、加热回流提取法)以及不同提取时间(20、30、40 min)，综合考虑各种因素，如提取方法的易操作性、运行成本、待测成分的提取率，最终确定巴戟天供试品溶液的制备方法以80%甲醇为提取溶剂、超声提取2次、每次提取时间为30 min。

本实验分别采用甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水作为流动相，发现以乙腈-磷酸水作为流动相时，各待测成分峰形及分离度较好，理论塔板数也较高，最终确定了流动相：乙腈(A)～0.2% 磷酸溶液 + 0.01 mol/L磷酸氢二钾缓冲盐(B)，梯度洗脱(0～12 min，1% A；12～30 min，1% A→17% A；30～40 min，17% A)。

因去乙酰基车叶草苷酸对照品价格便宜、容易获得、性质稳定，故本实验将去乙酰基车叶草苷酸为内参物进行一测多评分析。

本实验建立的QAMS法，首次实现对巴戟天中4种环烯醚萜类成分水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷的同时测定。通过方法学考察、相对校正因子耐用性实验以及QAMS法计算值与ESM法实测值RSD值的比较，表明本文所建立的方法操作便捷、结果准确，重复性好。解决了传统多指标成分评价模式对照品使用量大，检测成本高，部分对照品不易获得等不足。可为全面评价巴戟天的质量提供参考依据。

不同产地巴戟天各成分含量存在差异，其中以水晶兰苷的含量差异较为明显，其中第9批和第10批的水晶兰苷含量较低，其原因可能与巴戟天来源于不同产地有关。

综上所述，本实验建立的QAMS法，方法准确、可靠，重复性好，可为巴戟天的质量控制提供新的方法。