基于RAPD分子标记的烟草青枯病菌特异引物筛选及效果评价

李小杰，刘畅，李成军，杨立均，邱睿，宋瑞芳，陈玉国，白静科，李淑君*

1 烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室 河南省农业科学院烟草研究所，许昌 461000；

2 河南省烟草公司驻马店市公司，驻马店 463000；

3 中国烟草总公司河南省公司，郑州 450018

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范围广，可侵染50多科200多种植物[1]。烟草青枯病是危害世界烟草生产的重要根茎部细菌性病害，主要发生在我国长江流域及以南烟区，造成巨大损失[2,3]。近年来由于全球气候变暖，该病害已在河南、安徽、山东、陕西等地有不同程度的发生[4-7]。

烟草青枯病属于系统侵染的维管束病害，一旦发病很难得到有效控制。因此，如何在早期快速有效地检测青枯病菌对于防止青枯病蔓延和有效控制显得尤为重要。目前对于烟草青枯病的检测大多采用传统分离培养法和血清学鉴定法。其中，传统的鉴定方法需要分离得到纯化的单菌落菌株，检测过程耗时较长，很容易错过病害的最佳防治时间，对指导生产的意义不大。而血清学方法主要是利用特异的血清抗体进行免疫反应，且随着检测技术的发展已研制出高灵敏度的青枯病菌检测试纸条，对早期青枯病的快速检测起到了重要作用[8]，但该方法制备抗体过程耗时耗力，成本较高，且极有可能存在交叉反应，导致检测结果出现假阳性[9]。现代分子生物学方法可以不依赖于病原菌的纯培养和特异抗体的制备而对样品中的病原进行直接检测，可在短时间内检测到极微量的病原，大大提高了病原的检测效率。

目前利用RT-qPCR、LNA-qPCR、巢氏PCR等分子技术对青枯病菌进行检测的报道已有很多[10-14]，其检测关键是设计特异性引物。如杨娇弟等[15]根据已公布的5个青枯菌全基因组比对结果，筛选并验证得到3对引物能对土壤中烟草青枯菌进行特异性检测。郭淼淼等[16]分别以R. solanacearum染色体上的16S rDNA ITS以及毒性质粒携带的致病性相关基因fliC为靶点，筛选获得特异性扩增青枯菌的引物对RaITS-1/2和RalfliC-F/R，均能够稳定、快速、灵敏地检测青枯菌DNA。

青枯雷尔氏菌存在明显的生理分化，根据寄主范围差异，可分为5个生理小种[17,18]。根据生理小种划分标准，烟草青枯病菌属于寄主范围广泛的生理小种1号[17,19]。本研究利用RAPD分子标记技术，针对豫南烟区烟草青枯病菌1号生理小种III型生物型，筛选特异性片段并进行特异引物的设计，同时对其特异性和灵敏度进行PCR扩增验证，以期为河南省烟草青枯病的早期诊断和快速检测提供方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和烟草品种

烟草青枯病菌（R. solanacearum）、多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、节杆菌（Arthrobacter）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）由本实验室分离保存。烟草野火病菌由河南农业大学植物保护学院蒋士君教授惠赠。烟草品种中烟100和云烟87种子由河南省农业科学院烟草研究所育种研究室提供。

1.2 基因组DNA的提取

细菌、植物和土壤基因组总DNA的提取分别按照天根生物公司细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）、植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）和土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）说明书方法操作。

1.3 特异性引物设计、筛选与扩增

利用RAPD分子标记技术，以烟草青枯病菌、烟草野火病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌和烟草栽培品种云烟87、中烟100的基因组DNA为模板，利用随机引物筛选烟草青枯病菌的特异片段，将获得的特异片段送生工生物（上海）进行测序分析，再根据特异片段序列设计特异引物，引物合成由生工生物（上海）完成。RAPD反应体系（25 μL）：模 板DNA约50 ng，200 μmol/L dNTP，1.5 nmol/L MgCl2，0.1 μmol/L引物，200 μmol /L Ex-Taq DNA polymerase和1×PCR buffer；PCR扩增条件为：95℃ 5 min，94℃ 45 s，37℃ 90 s，72℃ 2 min，41

个循环；72℃ 10 min，4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.4 特异引物检测的灵敏度测定

青枯菌菌液最低检出浓度的测定 将青枯菌置于28℃摇床上过夜培养，以1 mL OD600≈1.0的细菌悬浮液中青枯菌数量为109个细菌的标准，梯度稀释细菌悬浮液，形成109cfu/mL，108cfu/mL，107cfu/mL，…，10 cfu/mL梯度细菌悬浮液。同时以青枯菌基因组DNA为模板（模板浓度为42 ng/μL），并将模板进行101、102、103、104、105倍稀释，形成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液。分别吸取1 μL菌液或DNA为模板，利用筛选出的特异性引物进行PCR扩增，并进行电泳检测。PCR反应体系（25 μL）：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，双蒸水补足到25 μL。PCR扩增条件：95℃ 3 min；94℃ 45 s，退火温度 45 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

土壤中青枯菌最低检出量的测定 将青枯菌置于28℃摇床上过夜，以OD600=0.5的细菌悬浮液中青枯菌数量为3×108cfu/mL的标准，梯度稀释到3×107

cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/

mL。分别吸取1 mL菌液加入5 g已灭菌的土壤中，过夜培养。称取0.2 g土壤提取总DNA，稀释一定倍数后作为模板，利用筛选出的特异引物进行PCR扩增。剩余4.8 g含菌土壤中加入45 mL水于摇床上震荡10 min，混匀后即为10-1土壤悬浮液，按梯度稀释成10-2、10-3、10-4、10-5倍土壤悬浮液，分别吸取1 μL上清做模板进行PCR。PCR反应体系和扩增条件同上。

1.5 盆栽接种后土壤和烟株体内青枯病菌的检测

将土壤高温灭菌后风干得到无菌土，选择健康的长至4-6片叶的烟株移栽于装有250 g无菌土的盆钵中（直径为上口径95 mm×高 75 mm）。采用伤根灌根法，每株烟苗灌青枯菌菌悬液（3×108cfu/mL）10 mL，设置3个重复，每个重复接种5株烟苗，以清水为对照处理。于接种后7 d进行病害调查和取样，青枯病分级参照中华人民共和国国家标准《烟草病虫害分级及调查方法》（GB/T23222-2008）进行调查。分别取烟株根际土壤和烟株茎基部组织（根部向上1～2 cm处）各0.1 g，加入0.9 mL无菌水进行研磨，制成悬浮液作为模板，利用特异引物扩增检测接种土壤和烟株体内青枯病菌的含量。

2 结果与分析

2.1 烟草青枯菌特异片段的获得

利用RAPD随机引物对8个供试基因组DNA进行PCR扩增，结果表明扩增条带表现出明显的多态性，从1000多个随机引物中筛选出能够扩增出烟草青枯病菌特异片段的引物6个（表1、图1）。测序结果表明，这6个特异片段分别代表青枯菌基因组中不同的基因序列，其片段大小和靶基因名称见表1。

表1 烟草青枯病菌特异片段的筛选Tab. 1 Screening of specific fragment of R. solanacearum

图1 RAPD随机引物的PCR扩增Fig. 1 PCR amplification of RAPD random primers

2.2 烟草青枯菌特异引物的设计与筛选

利用Primer 5.0软件，根据特异片段序列设计特异引物，共筛选出特异性扩增烟草青枯病菌的引物6对（表2）。电泳检测结果表明，筛选出的特异引物只在烟草青枯病菌基因组DNA中扩增出条带，且条带明亮单一，无杂带（图2）。

表2 烟草青枯病菌特异引物序列及扩增产物大小Tab. 2 Specific primer sequence and amplification product size of R. solanacearum

图2 烟草青枯菌特异引物的PCR扩增结果Fig. 2 Results of PCR amplification by specific primers for R. solanacearum

2.3 烟草青枯病菌菌液最低检出浓度

利用筛选出的特异引物对，分别以烟草青枯病菌不同稀释度的菌液和基因组DNA为模板进行PCR扩增。结果表明，对于基因组DNA，引物对A1T-F/R、

A6T-F/R、A7T-F/R、S6T-F/R、S13T-F/R、S18T-F/R检测的灵敏度均可达到105的稀释度，即0.42 pg/μL。对于青枯病菌菌液，引物对A1T-F/R、A6T-F/R、A7T-F/R、S13T-F/R能检测到的最低浓度为105cfu/mL，引物对S6T-F/R、S18T-F/R能检测到的最低浓度为106cfu/mL（图3）。

图3 特异引物的灵敏度检测结果Fig. 3 Results of sensitivity test for specific primers

2.4 土壤中烟草青枯菌的最低检出量

分别从每克土含菌量为1.2×107cfu、1.2×106cfu、1.2×105cfu、1.2×104cfu、1.2×103cfu的土壤中提取总DNA，并以稀释50倍的DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，结果表明，利用特异引物对S13T-F/R扩增检测的青枯菌最低含量为每克土含菌量为6×102cfu。对于土壤悬浮液，特异引物对S13T-F/R检测的最低浓度为102稀释度，即约3×106cfu/mL（图4）。其他5对特异引物的扩增结果与S13T引物一致。

图4 特异性引物对S13T-F/R对土壤中青枯菌的PCR扩增结果Fig. 4 Results of PCR amplification for R. solanacearum in soil by S13-TY pairs

2.5 烟草发病植株和土壤的快速检测

接种青枯病菌后7 d，分别取不同发病程度的烟株和根际土壤，利用特异引物对A1T-F/R和S13T-F/R进行PCR扩增（图5）。结果表明，接种的烟株根际土壤中均能扩增出青枯病菌的特异条带。对于烟株而言，只在病级为5的烟株中检测到青枯病菌，而健康烟株和病级为1的烟株中未检测出青枯病菌。由此说明，筛选出的特异引物不需提取土壤和中等发病烟株的总DNA，样品加水研磨的悬浮液即可直接用于快速检测。

图5 土壤和烟株体内青枯病菌的PCR检测Fig. 5 PCR detection of R. solanacearum in tobacco planting soil and tobacco plant

3 结论与讨论

目前RAPD（Random amplified polymorphisms DNA）分子标记技术已广泛地应用于品种鉴定、育种、基因定位、遗传多样性、种质差异等研究领域[20-23]，同时也可用于植物病原菌的分子诊断[24-27]，但利用该技术对烟草青枯病菌进行特异引物筛选还鲜有报道[27]。虽然青枯病菌的分子检测方法多样，但使用方法不同，对青枯病菌的检测灵敏度也有所差别。如黄雯等[28]根据青枯菌的lpx C基因序列设计得到4条LAMP特异性引物，对青枯菌的检测灵敏度为1.42 pg/μL基因组DNA；程承等[15]利用RT-qPCR检测方法，对试验土壤烟草青枯菌的最低检测浓度为5×102cfu/g土壤；李本金等[17]利用烟草青枯病菌的特异引物RsF/RsR与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增，其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL。本研究利用RAPD技术获得烟草青枯病菌的特异片段6个，通过引物设计，最终得到6对烟草青枯菌特异引物，其扩增条带明亮单一，特异性强。经对6种细菌（烟草青枯病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌、野火病菌）和2个烟草品种（中烟100和云烟87）的检测验证，所有引物的灵敏度在DNA水平上均可达到0.42 pg/μL，对烟草青枯菌悬液最低检出率为105～106cfu/mL，这与杨姣弟等[18]的研究结果基本一致。同时筛选出的6对引物能够特异且高效地检测土壤中的青枯菌含量，最低检出量为6×102cfu/g土壤总DNA，但对土壤悬浮液的检测灵敏度略低，这可能是由于土壤悬浮液作为模板，其复杂的成分影响了PCR反应导致扩增效率低造成的。

本研究筛选出的特异引物对A1T-F/R和S13T-F/R可直接用于接种土壤和中等发病烟株中青枯病菌的分子检测，无需提取样品DNA，效率更高，为河南省烟草青枯病的早期诊断提供了重要依据。但是轻微发病的烟株中未检测到青枯病菌，这可能是由于直接以烟株的组织研磨液模板，导致菌含量较低所造成的，因此青枯菌含量检测的灵敏性与烟株发病程度之间的关系还需进一步研究，以便为烟草青枯病的监测预警提供理论依据。另外，本研究设计的青枯病菌特异引物，只针对寄主为河南省主栽烟草品种中烟100和云烟87、生理小种为1号、生物型为III型的烟草青枯病菌，是否适用于其他寄主或生理小种的青枯病菌的检测，还需进一步测试。