海南H382雪茄烟叶不同发酵周期细菌群落多样性表征及演替分析

张鸽，李志豪，邓帅军，李东亮，张良，蔡斌，向小华，王娟，王帆，陈国强，张海波*，刘好宝*,,4

1 中国科学院大学研究生院，中国科学院青岛生物能源与过程研究所，生物基材料重点实验室，山东青岛 266101；

2 中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，山东青岛 266101；

3 中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口 571100；

4 青岛农业大学农学院，山东青岛 266109；

5 四川中烟工业有限责任公司，成都 610000

雪茄烟是一种特殊的烟草制品，传统概念上是指全部用烟叶卷成的烟卷，其香气醇厚，吃味透甜、浓度大[1]。经典的雪茄烟通常由茄衣（外包皮）、茄套（内包皮）和茄芯（芯叶烟）组成[2]。雪茄烟生产中，发酵是保证雪茄烟叶品质形成的关键环节，是改善雪茄烟叶外观质量、物理特性、内在化学成分、吸食品质的重要工序，被称为雪茄烟叶生产的技术核心[2-6]。

雪茄烟叶常见的堆垛发酵一般要经历初分级、回潮、堆垛、翻垛、重新码堆等几个重要过程[2]。微生物在雪茄烟叶发酵中发挥重要作用。19世纪80年代，小什列晋格提出微生物作用假说[7]，近年关于微生物在烟叶发酵中作用的研究逐渐深入，包括烟叶发酵中微生物群落的表征[8-10]、微生物在烟叶发酵提质增香中的作用[11-12]等。研究显示，细菌在烟叶发酵品质改善中发挥重要作用[4]，但雪茄烟叶发酵过程中细菌群落多样性、动态演替规律以及细菌群落在发酵中的作用尚不明确，有待进一步深入研究。本研究以海南省H382品种雪茄烟叶为实验材料，通过16S rRNA测序技术，在实验室条件下模拟人工发酵，对发酵过程中雪茄烟叶的细菌群落多样性和群落演替进行表征，并预测分析发酵过程中细菌的功能，期望为揭示雪茄烟叶微生物发酵机理提供理论参考，为筛选雪茄烟叶发酵功能细菌提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015—2016年度海南省乐东县抱由镇种植的雪茄烟叶中部烟叶，供试品种为H382。

1.2 试验方法

1.2.1 雪茄烟叶发酵及取样

（1）烟叶回潮

将雪茄中部烟叶按照30～35片/把的标准进行扎把，扎把后按相邻烟把间隔10～15 cm悬挂于回潮房内，在相对湿度75%～85%、温度25℃～27℃、回潮时间为8～10 h的条件下，进行雾化回潮处理[13]，回潮期间翻动烟把，保证烟叶回潮均匀，最终使烟叶含水量控制在25%～35%范围，作为待发酵实验样品。

（2）烟叶发酵及取样记录

将回潮好的烟叶置于自封袋中，装烟规格为6.0 kg，排掉自封袋中空气，将自封袋置于恒温恒湿培养箱中，培养箱中温度和湿度参数设定详见表1。按表1中温度湿度控制进行实验，每完成1个升温过程（28℃±1℃～50℃±1℃），为1个发酵周期，共进行6个发酵周期。每个发酵周期结束后取样200 g，包括初始样（YB_1），第1次发酵周期完成后取样（YB_2），第2次发酵周期完成后取样（YB_3），第3次发酵周期完成后取样（YB_4）、第4次发酵周期完成后取样（YB_5）、第5次发酵周期完成后取样（YB_6）及第6次发酵周期完成后取样（YB_7）。取样保证均匀，取样样品在液氮下研磨粉碎，混合均匀，取1.0 g±0.1 g作为细菌群落检测样本，送至上海美吉生物医药科技有限公司(http://www.majorbio.com/）检测。

表1 恒温恒湿培养箱中温度湿度变化程序设置表Tab. 1 The program of temperature and humidity in incubator

1.2.2 HTS 测序

微生物菌体收集、基因组提取、PCR扩增、文库构建及上机测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成，引物选用799F（5´-AACMGGATTAGATACCCKG-3´），1193R（5´-ACGTCATCCCCACCTTCC-3´），测序区域为V5-V7区域[9,14]。

1.2.3 生物信息学分析

（1）OTUs聚类：以97%的相似水平对OTU进行聚类，保留注释到细菌属的OTUs，基于最小样本序列数（34102）对OTU抽平。

（2）α多样性分析：利用Mothur 1.30.2（https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）计算Alpha多样性相关指数Shannon, simpson, Sobs, Chao1, ace,coverage。

（3）Beta多 样 性 分 析：基 于Bray_Curtis、weighted和unweighted Unifrac距离计算距离矩阵，使用PCoA进行结果可视化展示。

（4）PICRUSt功能预测：利用PICRUSt（http://picrust.github.io/picrust/）对细菌功能进行预测分析。

2 结果分析

2.1 H382 雪茄烟叶发酵样本测序OTU数目统计

根据表2 可知，在H382雪茄烟叶发酵过程中，OTU数目较多，细菌多样性丰富；其中以YB_3的OTU数目最多，为222；且在发酵过程中，由YB_2到YB_3，OTU数目呈增加趋势，YB_4，YB_5直至YB_6样本中呈现减少趋势，最后YB_7中OTU数目又有少量增加。细菌的多样性在发酵过程中呈现先增加后降低，最后略有增加，基本趋于平稳的趋势。

表2 发酵样本OTU数目统计Tab. 2 The numbers of OTU in samples

2.2 H382雪茄烟叶发酵样本测序结果的Alpha多样性分析

根据coverage和以Sobs指数为代表的稀释曲线（图1）趋势可知，测序结果能够覆盖雪茄烟叶发酵中表面细菌群落多样性。表3结果显示，所测样本中，YB_1和YB_3中的Sobs指数最大，与Chao1和ace指数趋势一致，说明YB_1和YB_3 2个样本中的物种总数最多；shannon数值中，YB_1、YB_2、YB_3和YB_4 4个样本中，数值相对较高，说明群落多样性高，与simpson指数反映的结果一致。

图1 H382雪茄烟叶发酵测序稀释曲线Fig. 1 The rarefaction curve in fermentation samples of H382 cigar leaves

表3 细菌群落α多样性指数表Tab. 3 The α diversity index of bacterial community

2.3 海南H382雪茄烟叶发酵过程细菌群落分析

根据表4统计结果可知，YB_1初始样本中共包含27个属，在发酵启动的YB_2样本中，细菌的种类及含量发生较大变化，Enterococcus、Bacillus、Oceanobacillus、Cronobacter以 及Paracoccus含 量分别由1.1%、0.63%、0.48%、0.23%和0.0088%上升至19%、9.4%、6.5%、2.9%和4.6%，提升比例分别为17.3、14.9、13.5、12.6和522.7倍，可能在H382雪茄烟叶发酵启动中发挥重要作用。相反，

unclassified-f-Enterobacterriaceae、Methylobacterium

以及Enterobacter含量分别由11%、5.4%和2.1%降低至0.58%，0.23%，0.0059%，可能在发酵启动中发挥作用较小。另外，Aerococcus和Georgenia在YB_2中含量接近为0，且Aerococcus在发酵过程中含量极少，在YB_4、YB_6和YB_7样本中含量痕量，接近为0（出现结果为0的原因有二方面，一方面因测序中OTU是采用97%的相似度聚类，可能存在合并；另一方面测序结果按样本最小序列数做了抽平处理，导致有数字“0”出现），推测其在发酵中发挥作用较小；其余细菌种类含量变化差异相对较小，其 中，Terribacillus、Cronobacter、Lysinibacillus含量有小幅度提升，可能在发酵启动中也发挥部分作用。其余细菌种类都有小幅度降低，可能在发酵启动中发挥作用较小。关于这些微生物在烟叶发酵中具体作用，需要后续进一步开展单个菌株的发酵验证试验。

在整个雪茄烟叶发酵过程中，自始至终有17个细菌属全程贯穿整个发酵，其中Staphylococcus、Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus 4个 属 基本呈现先降低后略微增加的趋势，可能在发酵后期发 挥 较 大 作 用；Pseudomonas、Methylobacterium、

Sphingomonas、Stenotrophomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus、Aureimonas、Microbacterium和Paracoccus 11个属基本呈现先增多后降低的趋势，尤其Pseudomonas、Sphingomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus和Paracoccus7个属，所占比例相对较大，可能发酵前期发挥的功能更明显。Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus3个属基本变化波动较大。另外，Staphylococcus在所有样本中均大量存在，YB_1中含量较高，YB_2、YB_3和YB_4样本中含量逐步降低，随后样本中含量大幅度增加并趋于稳定。Staphylococcus可能在发酵前期发挥作用较小，在稳定期及初始样本中含量相对稳定。

表4 属水平上不同样本中细菌种类、所占比例及具体OTU数目统计Tab. 4 The bacterial species, proportion and the number of OTUs in different samples at genus level %

在本实验条件下，发酵过程中主要的细菌群落演替规律如图2所示：由发酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演变为发酵中期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，随后演变为Pseudomonas和Enterobacter，最后稳定为Staphylococcus和Terribacillus。

图2 属水平上发酵样本中细菌群落组成及演替柱状图Fig. 2 The bacterial community composition and succession histogram in fermentation samples in genus level

另外，对雪茄烟叶发酵样本中的OTU聚类进行分组总结，结果（表5）所示，在雪茄烟叶发酵过程中，细菌种类所占比例大部分在0.1%～1%和1%～10%之间，虽然这部分细菌种类占比较小，但细菌种类丰富，可能在烟叶发酵中发挥较为重要作用。

表5 雪茄烟叶发酵样本中每个占比分组统计中OTU数目Tab. 5 The number of OTUs in each group during fermentation of cigar leaves

2.4 样品Beta多样性分析

PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐标分析，可用来研究样本群落组成的相似性，在PCoA结果中显示为群落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起。

图3中的7个点分别代表海南H382雪茄烟叶发酵中的7个样本，两样本越接近，表明两样本物种组成相似度越高。基于unweighted UniFrac distances的PCoA结果分析表明，7组样本基本可分为3组，其中的YB_1和YB_2样本相似度较高，为Ⅰ组；YB_3和YB_4样本相似度较高，为Ⅱ组；YB_5、YB_6和YB_7 3组样本的相似度较高，为Ⅲ组。

图3 H382雪茄烟叶发酵样本的PCoA结果Fig. 3 The PCoA result in fermentation samples of H382 cigar leaves

2.5 H382雪茄烟叶发酵样本测序结果PICRUSt功能预测及分组比较

16 S的直系同源簇COG（cluster of orthologous group）功能预测是通过PICRUSt[15]对OTU丰度表进行标准化，获得OTU对应的COG家族信息，并计算各COG的丰度。根据比对到COG库的COG编号，可以从eggNOG数据库中解析到各个COG的描述信息及其功能信息，从而得到功能丰度谱。

根据图4结果分析可知：不同发酵样本中涉及的COG功能种类基本一致，但功能的相对丰度有较大差异（表6）。

图4 发酵样本的COG功能预测Fig. 4 The COG function prediction in fermentation samples

表6 所测发酵烟叶单一样本中细菌功能预测统计表Tab. 6 Function prediction of bacterial in each fermentation sample

续表6

由图5结果可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、3组的预测功能种类上差异较小，但功能丰度差异较大，其中以Ⅱ组丰度最高，Ⅰ组次之，Ⅲ组最低。根据预测结果可知，Ⅰ组（YB_1，YB_2）前五位可预测功能为：氨基酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、通用功能预测、转录以及无机离子运输和代谢；Ⅱ组（YB_3，YB_4）前五位可预测功能为：氨基酸运输和代谢、通用功能预测、转录、碳水化合物运输和代谢以及无机离子运输和代谢；Ⅲ组（YB_5，YB_6，YB_7）前五位可预测功能为：通用功能预测、氨基酸运输和代谢、转录、无机离子运输和代谢和翻译、核糖体结构和生物转化。尤其在发酵关键阶段中，氨基酸运输和代谢和碳水化合物运输和代谢功能丰度更高。

图5 分组样本功能预测比较分析结果Fig. 5 The comparative analysis results of function prediction in three groups

3 讨论

3.1 H382雪茄烟叶发酵中细菌多样性表征及群落演替分析

16 S rRNA高通量测序技术在表征细菌群落多样性中应用广泛[14,16-20]。通过对海南H382雪茄烟叶发酵过程中细菌群落多样性及演替规律进行表征，初步认识到在不同发酵时期发挥作用的主体微生物不同。根据测序结果，海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、土地芽胞杆菌属（Terribacillus）、副球菌属（Paracoccus）、芽胞杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等细菌在雪茄烟发酵关键阶段中的丰度较高，其中，芽孢杆菌属占比重较高，与前期对墨西哥雪茄烟叶中的微生物种类研究基本相同，但含量略有差异[9]。海洋芽孢杆菌属、土地芽孢杆菌属、副球菌属以及肠杆菌属等菌属在雪茄烟叶发酵中均为首次发现，为研究雪茄烟叶发酵微生物多样性及功能提供了新的依据。海洋芽孢杆菌、土地芽胞杆菌属及芽孢杆菌属生理特性丰富多样，能分泌淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等[21,22]，推测其在烟叶发酵大分子物质降解中发挥重要作用[23-26]。烟叶中果胶物质不完全燃烧会形成甲醇，并进一步氧化成甲醛、甲酸等[27]，增加烟叶风险，并且研究表明，烟叶中果胶含量会影响烤烟的柔韧性[28]，在雪茄外包皮烟叶（茄衣）研究中，适度降解烟叶中果胶物质含量，可能会有助于提升雪茄外包皮烟叶（茄衣）的韧性，改善茄衣的物理特性。此外，烤烟中研究发现纤维素不完全燃烧会使烟叶刺激性增大，产生呛咳感[29]，根据功能预测，推测芽孢杆菌属可能在降低雪茄烟叶刺激性、改善雪茄烟叶品质中发挥作用。假单胞菌属在尼古丁降解[30,31]方面研究较多，有可能在调整烟叶劲头，改善上部烟叶品质上具有重要作用。刘燕等[32]研究发现副球菌具有脱氮反硝化特性，马永见等[33]研究发现副球菌属具有邻苯二价酸酯降解特性，鞘氨醇单孢菌在生物降解方面[34,35]具有重要作用。值得关注的是，葡萄球菌属的存在与前期墨西哥雪茄烟叶表面细菌群落结果和较早关于雪茄发酵中的结果[4,9]一致，但关于葡萄球菌属在雪茄烟叶发酵中的作用还未进行深入研究。

将微生物的功能研究进行分类整理，对挖掘其在雪茄烟叶发酵中的作用具有指导意义，但微生物生长环境不同，代谢活动也有差异，具体在雪茄烟叶发酵中如何发挥作用，需要进一步验证。且雪茄烟叶的微生物发酵是混菌发酵的过程，细菌的功能研究不能仅仅局限在单一菌群的作用中，混菌的研究及使用在雪茄烟叶发酵中更为重要，以便为雪茄烟叶的人工发酵控制提供指导。

3.2 海南H382雪茄烟叶发酵中细菌功能预测

PICRUSt分析与数据库比对，将微生物的变化情况和生物功能联系，能初步揭示不同样本下细菌功能的差异[15,36]。本实验使用PICRUSt功能预测，分析发酵过程中样本间的功能差异，并根据PCoA结果，将相似度较高的样本进行分组功能预测。可知在发酵过程中，氨基酸运输和代谢以及碳水化合物运输和代谢两种功能丰度最高，尤其在Ⅱ组中，一方面可能与Ⅱ组包含的两个样本中所含OTU种类较丰富有关，另一方面可能由于YB_3和YB_4两个样本中，Oceanobacillus、Paracoccus、Pseudomonas等细菌种类所占的比例急剧增加，参与了雪茄烟叶发酵中的含碳化合物和含氮化合物的降解过程，维持菌体自身生长代谢。

将优势微生物与功能预测结果相结合，有利于筛选雪茄烟叶发酵过程中的功能微生物，对揭示雪茄烟叶的发酵过程和发酵机理、微生物在雪茄烟叶发酵中的作用具有重要意义。但PICRUSt功能预测存在局限性，随科技进步，后期结合宏基因组测序[36]，对筛选功能基因和功能微生物以及揭示烟叶微生物的发酵机理具有重要意义。雪茄烟叶的人工发酵是一个多周期的过程，发酵中会涉及翻堆、重新码堆等操作[37,38]，研究雪茄烟叶的发酵机理，应结合发酵工艺，不仅对多个发酵周期进行细致研究，更需要对一个发酵周期内的关键点，如烟叶成分明显发生降低或增加的点，温度明显增加、降低或平稳的点等，包括结合微生物演替变化规律、酶活变化、烟叶成分及含量变化、环境因子变化以及雪茄烟叶评价进行统一分析，不仅更有助于揭示雪茄烟叶的发酵机理，更为人工精准控制雪茄烟叶发酵提供理论指导。

4 结论

明确了H382雪茄烟叶发酵过程中细菌群落组成多样性丰富，优势菌群主要为葡萄球菌属、海洋芽胞杆菌属、假单胞菌属等；在本实验条件下，发酵过程中首要的细菌群落演替规律为：由发酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演变为发酵中 期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，随后演变为Pseudomonas和Enterobacter，最后稳定为Staphylococcus和Terribacillus；细菌主要功能预测为氨基酸运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢等。本文为揭示雪茄烟叶的微生物发酵机理提供了一种新的研究思路。