外源甜菜碱及水杨酸对锰胁迫下烟草生理特性的影响

2021-06-05陈锦芬顾开元贾雨豪成欣邹聪明谢小玉

中国烟草学报 2021年2期

陈锦芬，顾开元，贾雨豪，成欣，邹聪明，谢小玉*

1 西南大学农学与生物科技学院，重庆北碚 400715；

2 云南省烟草农业科学研究院，云南昆明 650021

锰是作物生长所必须的重要元素之一，它参与了植物的光合作用、氧化还原反应及多种酶代谢过程[1]。但是，高锰胁迫下容易引发植物体内的一系列危害，包括植株生物量减少[2]，种子发芽率降低[3]，矿质元素吸收、光合系统[4]及抗氧化酶系统[5]紊乱。因此，高锰胁迫成为我国农业生产的重要限制因素。烟草是我国西南地区的重要经济作物，该地区多为酸性土壤，部分地区有效锰含量极丰富，易引起锰过量症[6]。已有研究表明，锰过量胁迫会引起生理性中毒，并最终对烤烟外观质量与内在品质造成不良影响[7]。因此减轻高浓度锰胁迫对植物的危害具有十分重要的意义。

已有研究表明，施加外源水杨酸[8]及甜菜碱[9]对植物重金属胁迫有缓解作用。水杨酸是一种植物体内重要的酚类物质，施加外源水杨酸可以提高植物的抗逆能力[10]。外源水杨酸可以促进NaCl胁迫下叶片中光合色素的合成，从而促进了叶片光合作用[11]；王小红等[8]研究发现施加外源水杨酸可以显著提高镉胁迫下抗氧化酶的活性，并显著降低镉胁迫下对抗氧化酶活性的抑制作用；张晓等[12]认为，水杨酸可以促进镉胁迫下幼苗的生长并降低镉在其体内的积累。

甜菜碱是一种渗透保护剂，它广泛存在于动植物体中，可帮助植物抵御逆境带来的伤害[13]。根施外源甜菜碱可以提高胡杨叶片的耐盐力；在对烟草的研究中也发现，甜菜碱可以降低其对镉的吸收及积累，从而减缓镉的毒害作用[14]。

目前，已有许多关于外源物质对烟草镉胁迫的缓解的研究，但是对于锰胁迫的研究还未见报道。因此，本研究以烟草红花大金元为试验材料，采用盆栽试验方法探究高锰胁迫对烟草生理特性的影响及外源水杨酸、甜菜碱对烟草抗氧化系统及锰积累的影响，以期探明烟草生产中锰胁迫缓解的生理机制及缓解锰胁迫的最适水杨酸和甜菜碱浓度，为解决生产中烟草锰胁迫问题提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验设计

试验于2019 年4 月至8 月在西南大学2 号温室进行。将烟草种子播种于育苗盘中，培养至4叶1心时，选取长势一致、无病害的烟苗移栽至装有8 kg壤土的花盆中，按照常规方式供给水肥。盆底放置托盘以防根系伸出，待烟草长至旺长期时开始进行胁迫处理。每处理三重复，每重复3盆，每盆留1株烟苗。于早上9：00～ 10：00对每盆烟苗根灌以MnSO4·H2O配成的Mn2+含量为500 mg/kg（根据前人研究结果与前期预备试验筛选）的水溶液1L，对照组（CK）以等量蒸馏水代替，共浇灌3次，每两次之间间隔一周；在第3次胁迫处理后的第3天，开始进行缓解处理（在前期预实验基础上分别筛选出4个浓度梯度），即在每天早上9：00～ 10:00分别根灌水杨酸（SA）和甜菜碱（GB）溶液200 mL，对照（CK）及锰胁迫对照（CK1）根灌等量蒸馏水。每天1次，共浇3天，3天后取自上而下第4～6片叶剪碎混匀用以测定相关指标。

试验采用随机区组方法，共有10个处理，具体试验设计见表1。

表1 试验设计Tab. 1 Test design

1.2 测定项目及方法

1.2.1 最大叶长叶宽测定

1.2.2 锰含量测定

取部分混匀后的叶片，置105℃的烘箱中杀青30分钟后于80℃中烘至恒重。然后用粉碎机粉碎过0.2 mm筛。称取0.5 g样品加入7.5 mL浓硝酸和1.5 mL高氯酸，混匀后进行消解，得到白色透明的消化液后用去离子水洗入50 mL容量瓶并定容，使用原子分光光度仪（AA7000，岛津）测定锰含量[16]。

1.2.3 生理指标测定

称取部分混匀后的叶片0.2 g剪碎，置于20 mL去离子水中，真空抽提2～3次，在20℃～25℃恒温下用电导仪测定电导率T1，测完再放入100℃沸水中水浴30 min，取出后自然冷却至室温测定煮后电导率T2，相对电导率（REC）= T1/ T2×100%。

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丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法测定；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）活性分别采用氮蓝四唑法、愈创木酚法及紫外吸收法测定；可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（SS）和脯氨酸（Pro）含量分别采用考马斯亮蓝G-250法、蒽酮比色法和磺基水杨酸法测定[17-18]；过氧化氢（H2O2）及超氧阴离子产生效率采用试剂盒（上海优选生物科技有限公司生产）测定。

1.3 数据分析

采用软件Excel 2010和SPSS 22.0对数据进行分析。采用邓肯（Duncan’s）法进行方差分析，采用皮尔逊（Pearson）法进行相关性分析。采用隶属函数值法对锰胁迫缓解程度进行分析：当外源缓解物质的施用与该指标测定值呈正相关时，选用公式：Z(i)=（Zi- Zmin）/（Zmax- Zmin），呈负相关时则选用公式：Z(i)=1-（Zi - Zmin）/（Zmax- Zmin）。式中：Z(i)为某系列指标的隶属值，Zi为某系列指标的测定值，Zmax为该系列指标测定的最大值，Zmin则是最小值，最后取所有指标的平均值即为该处理的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对烟草最大叶长叶宽的影响

图1表明，锰胁迫（CK1）下最大叶长、叶宽均显著降低。施加外源水杨酸及甜菜碱后最大叶长的变化不明显；经外源缓解物质处理后S2、S3的最大叶宽最大，较CK1分别增加了26.09%及28.26%，差异达到显著水平。

图1 不同处理对烟草叶片最大叶长、叶宽的影响Fig. 1 Effect of different treatments on maximum length and width of tobacco leaves under manganese stress

2.2 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对烟草锰含量的影响

图2表明，锰胁迫（CK1）下烟草叶片的锰含量增加了14.8倍。施加外源缓解物质后的各处理叶片中的锰含量下降。其中G3和S2处理下的锰含量最低，即当外源甜菜碱浓度为0.20 mol/L、外源水杨酸浓度为150 mg/L时，对烟草锰胁迫的缓解效果最好。

图2 不同处理对烟草叶片锰含量的影响Fig. 2 Effect of different treatments on manganese content of tobacco leaves under manganese stress

2.3 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对烟草中相对电导率及丙二醛含量的影响

图3表明，锰胁迫（CK1）下烟草叶片的相对电导率及丙二醛含量分别增加了115.74%和48.85%。相对于锰胁迫处理，施加外源物质后二者均降低，其中G3处理和S2处理烟叶的相对电导率分别降低了25.50%和29.82%、丙二醛含量分别降低了29.92%及31.38%达到最低水平。

图3 不同处理对烟草中相对电导率及丙二醛含量的影响Fig. 3 Effect of different treatments on relative electrical conductivity and MDA content of tobacco leaves under manganese stress

2.4 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对3个抗氧化酶活性的影响

图4表明，锰胁迫（CK1）下烟草叶片的抗氧化酶活性均显著提高，施加外源缓解物质后活性受到抑制。当外源甜菜碱浓度为0.20 mol/L时，SOD及CAT活性最低，POD则是在G4水平活性最低；当外源水杨酸浓度为200 mg/L时，SOD及POD活性受到抑制的程度最大，而CAT活性在浓度为150 mg/L时最低，较CK1降低了34.46%，达到最低水平。

图4 不同处理对烟草中抗氧化酶活性的影响Fig. 4 Effect of different treatments on antioxidant enzyme activity of tobacco leaves under manganese stress

2.5 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量的影响

图5表明，锰胁迫处理（CK1）会使渗透调节物质含量增加，施加外源物质后下降。当外源甜菜碱浓度为0.15 mol/L时，可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的下降幅度最大，分别降低了11.91%、43.28%及33.93%达到最低，与CK1差异显著；三者的含量随外源水杨酸浓度变化差异较大，其中可溶性蛋白在水杨酸浓度为100 mg/L时含量最低且呈现随浓度升高含量逐渐上升的趋势，可溶性糖含量在S4处理时含量达到最低，当水杨酸浓度为150 mg/L时脯氨酸含量最低，较CK1显著降低25.33%。

图5 不同处理对烟草中可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影响Fig. 5 Effects of different treatments on the contents of soluble protein, soluble sugar and proline in tobacco leaves under manganese stress

2.6 不同浓度的外源甜菜碱及水杨酸对H2O2含量及O2-产生速率的影响

图6表明，锰胁迫处理（CK1）使烟草叶片的过氧化氢含量及超氧阴离子产生效率显著提高，施加外源物质后则降低。当外源甜菜碱浓度为0.25 mol/L时过氧化氢含量达到最低，不同浓度外源水杨酸处理下，过氧化氢含量差异不显著；施加外源物质后超氧阴离子产生速率显著降低，其中当外源甜菜碱浓度为0.15 mol/L，外源水杨酸浓度为150 mg/L时，产生速率达到最低。

图6 不同处理对H2O2含量及O2-产生速率的影响Fig. 6 Effect of different treatments on H2O2 contents and O2 production rate of tobacco leaves under manganese stress

2.7 最佳缓释剂浓度筛选

采用隶属函数分析结果表明（表2），各指标中综合评价值排名第1和第2的是S2和G3，即当外源甜菜碱浓度为0.20 mol/L，外源水杨酸浓度为150 mg/L时缓解效果最好。

表2 不同处理对锰胁迫缓解的综合评价Tab. 2 Comprehensive evaluation of manganese stress mitigation under different treatments

2.8 各生理指标与锰含量的相关性分析

烟草叶片的锰含量（Mn）可以反映其锰胁迫的程度，对烟草锰积累量和各指标进行相关性分析，结果（表3）表明，锰含量（Mn）与相对电导率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及脯氨酸（Pro）含量呈极显著正相关，与过氧化氢酶活性（CAT）、可溶性蛋白（SP）及可溶性糖含量（SS）、过氧化氢（H2O2）含量呈显著正相关。即在锰胁迫下可通过测定相对电导率、超氧化物歧化酶活性及脯氨酸含量的高低判定外源物质缓解烟叶锰胁迫的情况，这3个指标测定值越高，锰对烟叶的胁迫越严重。

表3 锰含量与各生理指标之间的皮尔逊相关系数Tab. 3 Pearson correlation coefficients between Mn content and physiological indexes

3 讨论

3.1 外源甜菜碱及水杨酸对烟叶最大叶长、叶宽的影响

肖泽华等[3]研究发现，锰对黄花草幼苗生长有高抑低促的作用，且较高浓度的锰胁迫浓度会显著降低其生物量的产生。在本试验条件下，根灌3次500 mg/kg的锰会显著降低烟草叶片的最大叶长及叶宽值，这与他们的研究结果一致。施加甜菜碱及水杨酸后，最大叶长叶宽的增长量与CK1相比并不十分显著，这可能是因为外源物质的施用与取样所间隔的时间较短，所以变化并不明显。

3.2 外源甜菜碱及水杨酸对锰含量的影响

有研究发现，施加外源水杨酸[20]及甜菜碱[21]可以降低重金属的毒性。金政等[19]通过研究也发现随着锰离子浓度的升高，西南木荷植株的锰含量也会逐渐升高；Shi等[22]发现施用外源水杨酸可以降低黄瓜叶片中锰离子的积累，这可能是因为水杨酸可以调节离子的跨膜运输[23]，从而抑制了锰离子在植株体内的积累。在本试验条件下，本试验研究表明，高锰胁迫使烟草锰含量显著提高，施加水杨酸及甜菜碱会显著降低烟草中的锰含量，这与孟德佳[18]等的研究结果一致。

3.3 外源甜菜碱及水杨酸对相对电导率及丙二醛含量的影响

在本研究中，高锰胁迫使烟草叶片中的相对电导率及丙二醛含量显著上升，这与袁满[24]等的研究一致。前人研究发现，外源施加甜菜碱及水杨酸可以显著降低胁迫下植株叶片中相对电导率及丙二醛含量[25-27]，本研究也证实了这一点。此外，在本试验条件下，随着外源甜菜碱及水杨酸浓度的升高，相对电导率及丙二醛含量先下降后升高，这与锰积累量的变化规律一致，这说明外源物质在较低浓度水平下可缓解锰的胁迫，但是过高的浓度依然有可能会对植物造成另一种胁迫。其中，在G3及S2处理相对电导率及丙二醛含量均达到最低，这与隶属函数分析的结果一致。

3.4 外源甜菜碱及水杨酸对三个抗氧化酶活性的影响

在本研究中，与CK相比，遭受锰离子胁迫的CK1处理的抗氧化酶活性均显著提高，这可能是因为逆境下植物中活性氧含量会上升，从而激活了体内的抗氧化系统。但是通过彭喜旭等[28]研究发现，虽然SOD及POD的活性会因胁迫而上升，但是不一样的是过氧化氢酶活性在遭到胁迫后不升反降，它的这种变化可能与植物对锰胁迫所产生的分子应答有关[29]，所以还有待进一步探究。在本试验条件下，通过根灌甜菜碱及水杨酸发现酶活性受到抑制，这与张晓[12]及李雷[20]等的研究结果一致，其产生的原因可能是因为外源物质的施用抑制了ROS的过度积累，所以导致抗氧化酶的活性也受到了抑制。本研究发现，SOD及CAT活性在外源甜菜碱浓度为0.20 mol/L、外源水杨酸浓度为150 mg/L时受抑制的程度最大，说明该浓度的缓解效果最好。

3.5 外源甜菜碱及水杨酸对可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影响

前人研究发现，在重金属胁迫下，烟草渗透调节物质的含量会升高[30-32]，本研究亦证实了这一点。甜菜碱和水杨酸均是重要的渗透调节物质，我们发现，外源施加这两种物质可以有效降低渗透调节物质的含量，且总体呈现出在低浓度效果更佳的趋势，这可能是因为它们的施入使细胞渗透势下内任何物质含量的变化都是由许多不同的代谢共同影响的，所以导致了三种渗透调节物质的变化规律并不完全一样，这与后有丽等[33]的研究结果一致。其中，可溶性蛋白及脯氨酸含量均在浓度0.15 mol/L甜菜碱及浓度150 mg/L水杨酸处理下达到最低，这与隶属函数分析结果一致。

3.6 外源甜菜碱及水杨酸对H2O2含量及O2-产生速率的影响

前人研究发现，当植物受到胁迫时，体内会积累大量的活性氧[35]，所以当烟草受到锰胁迫的时候，H2O2含量及O2-产生速率显著提高，这会对其造成损伤，但是施加了外源物质以后ROS的含量明显降低，说明对ROS的产生有一定的抑制作用。在本试验条件下，研究发现通过对烟草进行锰胁迫会使其H2O2含量及O2-产生速率显著提高，但是施加了甜菜碱及水杨酸以后会略有下降，这与Su等[34]通过利用乙酰胆碱对烟草镉胁迫进行缓解的研究结果一致。