miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化中的表达及靶基因的生物信息学分析
2021-06-05孙彦杰李耀强
孙彦杰,李耀强,齐 冉,吴 琼
(1. 河北医科大学第二医院, 河北 石家庄 050000;2. 平乡县人民医院,河北 平乡 054500)
目前,临床上非酒精性脂肪性肝纤维化的发病率较高,肝纤维化是慢性肝炎进展为肝硬化的重要病理过程,其发病机制及分子靶标的探明可为该病的早期诊断及治疗提供理论依据。近年研究发现microRNAs(miRNAs)参与细胞分化、凋亡及增殖等多种生物学过程[1-3]。miR-150-5p是位于6号染色体上的非蛋白编码区域加工产生的小分子RNA,既往对miR-150的研究主要集中在癌症领域,近年研究表明miR-150可抑制肝星状细胞的激活[4],降低CollagenⅠ及α-SMA的表达[5],阻止肝纤维化的进展,但其在非酒精性脂肪性肝病中的作用不明。本研究应用基因芯片技术筛选获得在非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠模型肝组织中差异表达的miR-150-5p,通过生物信息学方法预测miR-150-5p靶基因,对其靶基因进行功能及信号通路富集分析,旨在为深入研究miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展中的作用奠定基础。
1 实验材料和方法
1.1实验动物 清洁级8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠20只,体重20~25 g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,动物合格证号:(11401300055019)。饲养于医院动物中心,温度控制在(23±1)℃,自由饮食,昼夜各12 h。本实验所有操作程序经河北医科大学伦理委员会批准。
1.2实验方法 随机将小鼠分为2组,模型组10只以胆碱-蛋氨酸缺乏饲料喂养建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型,正常组10只以胆碱-蛋氨酸充足的饲料喂养,2组均喂养8周后水合氯醛麻醉处死小鼠,留取肝组织标本。
1.3观察指标及方法
1.3.1肝组织中miR-150-5p表达检测 提取2组小鼠肝组织中RNA,紫外分光光度仪测定A260/280,确定RNA纯度。采用microRNA(miRNA)芯片技术检测miR-150-5p表达情况。miRNA芯片微阵列实验由LC Sciences公司进行,用4~8 μg总RNA样品,使用Poly(A)聚合酶在中RNA 3'端加上poly(A)尾巴,再将一个寡聚核苷酸标记于这个poly(A)尾巴连接用于后续的荧光标记,在μParaflo微流体芯片上进行34℃过夜杂交,RNA与探针杂交后,与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上染色。利用激光扫描仪(GenePix 4000B,Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)进行图像数字化转换,数据分析使用LOWESS过滤(Locally-Weighted Regression)进行信号归一化。将差异表达谱中log2模型/对照>2.0或<0.5作为筛选条件,筛选出miR-150作为本次研究对象。应用实时定量PCR验证芯片结果。实时定量PCR扩增条件:95 ℃变性10 s,60 ℃退火,72 ℃延伸,共进行40个循环。以2-△△Ct表示miRNA的表达水平,每个样本重复3次实验。数据以均数±标准差表示,差异比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
1.3.2miR-150-5p序列保守性分析及靶基因预测 选择miRBase(http://www.mirbase.org/)、UCSC(http:// genome.ucsc.edu/)和Ensembl(http://www.ensembl.org/)基因组在线浏览工具获取miR-150-5p碱基序列、染色体定位、物种保守性等基本信息;选择TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、miRanda(http://www.microrna.org/)靶基因预测网站预测miR-150-5p靶基因,取三者预测数据的交集形成靶基因集合用于后续分析。
1.3.3miR-150靶基因的功能富集分析 采用Gene Ontology(GO)(http://www.geneontology.org/)分析对靶基因集合进行GO注释描述,采用BiNGO对靶基因的分子功能(molecular function,MF)、生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)进行GO注释层次分类及富集分析,并进行显著性分析[4]。
1.3.4miR-150靶基因的信号转导通路分析 在GO注释分类的基础上,采用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)公共数据库对靶基因进行信号转导通路富集分析,通过Fisher Exact Test计算P值,P<0.05表示靶基因集合有统计学意义的信号转导通路及疾病通路。
2 结 果
2.1小鼠肝组织中miR-150-5p表达情况miRNA芯片检测显示模型组小鼠肝组织中miR-150-5p表达较正常组明显上调,log2模型/对照为1.32,P=0.0218;实时定量PCR检测,模型组小鼠肝组织中miR-150-5p表达水平为(1.83±0.31),正常组为(1.03±0.22),模型组明显高于正常组(P<0.05)。
2.2miR-150-5p序列保守性分析 人miR-150-5p位于6号染色体135545397-135545425位置之间。应用miRBase对人、小鼠、果蝇等物种的miR-150-5p序列进行分析,发现miR-150-5p中“UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG”22个碱基在物种间高度保守。见表1。
2.3miR-150-5p靶基因预测情况 应用miRanda、TargetScan及PicTar预测miR-150-5p靶基因数量分别为275个、209个、9 583个。对3种预测方法的结果取交集,共获得132个靶基因。DIANA LAB-Tarbase 6.0 数据库收录已有试验数据支持的miR-150-5p靶基因共7个,分别为Myb、Vegfa、EGR2、P2RX7、VEGF、AGA等。
2.4miR-150-5p靶基因GO分析情况 针对以上132个靶基因,进行GO注释描述、富集分级及层次网络的图形化显示。结果从分子功能看,miR-150-5p的靶基因主要调节ATP结合、嘌呤核苷酸结合以及蛋白酶的活性等(P均<0.05)。从生物学过程看,miR-150-5p主要参与磷脂代谢、蛋白质氨基酸的磷酸化和去磷酸化、血管再生与重建及促凋亡等。见表2及表3。
表3 miR-150-5p预测靶基因GO生物学过程分类
表2 miR-150-5p预测靶基因GO分子功能分类
2.5miR-150-5p靶基因信号通路富集分析情况 miR-150-5p靶基因结合的信号转导通路显著富集于胰岛素信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路(P均<0.05),另外还涉及细胞凋亡、细胞周期过程等信号通路(P均<0.05)。见表4。
表4 miR-150-5p预测靶基因KEGG信号通路富集分析
3 讨 论
miRNA是生物体内一类长度为22~25个核苷酸的内源性非编码单链小RNA,通过与其靶基因mRNA 3'UTR区结合,降解或抑制靶基因mRNA的翻译过程,因此寻找miRNA的靶基因是探明其参与及调控疾病发生及进展机制的关键步骤。每种miRNA可以调控数百种靶基因的mRNA,而且一种靶基因的mRNA也可能受到多种靶基因的共同调控[2],所以通过生物信息学准确预测miRNA靶基因,明确miRNA与靶基因的作用方式,对miRNA的深入研究具有重要意义。miR-150在缺氧诱导的新生儿肝脏再生[6],在白色脂肪组织[7]、系统性硬化症纤维母细胞[8]中表达下调,提示miR-150在肝组织再生、肥胖及系统性红斑狼疮的纤维化形成等过程中发挥重要作用,可以作为潜在的生物标记物及治疗的作用靶点。
miRanda、TargetScan和PicTar是目前miRNA靶基因的主要预测软件[9],各自有不同的计算方法。miRanda数据库是最早利用生物信息学方法对miRNA靶基因进行预测的软件,其预测阳性率达24%~39%,预测的靶基因数目较多,但假阳性率也较高[10];TargetScan是一种预测哺乳动物miRNA靶基因的软件,与miRanda不同,TargetScan引入了“miRNA种子区”的概念,预测的靶基因减少,但准确性得到了相应的提高,降低了假阳性率[11];PicTar同样强调“种子区”在靶位点识别的关键作用,不同的是PicTar把种子序列分为“完全匹配种子序列”和“不完全匹配种子序列”,进一步提高准确度,降低假阳性率[12]。本研究采用上述3种预测软件进行miR-150-5p靶基因的预测,选取预测结果的交集,以提高预测结果的可靠性,降低假阳性率。
本研究应用miRNA芯片技术筛选出差异表达miRNA,采用生物信息学方法对miR-150-5p进行靶基因保守分析及预测,发现miR-150-5p序列在多种物种中高度保守,表明其可能具有较强的生物学功能。对预测所得的靶基因集合进行功能和信号转导通路富集分析,发现miR-150-5p靶基因功能主要富集于磷脂代谢、蛋白质氨基酸的磷酸化和去磷酸化、血管再生与重建及促凋亡等生物过程,信号通路主要富集于胰岛素信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、糖代谢信号通路及凋亡信号通路等。胰岛素信号通路与非酒精性脂肪性肝纤维化的发生发展密切相关[13]。在MAPK信号转导通路中,c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及细胞外信号调节激酶(ERK)都参与了肝星状细胞的增殖与活化,miR-150-5p通过调控这些信号通路中的关键基因及其下游的炎症及纤维化相关基因,进而调节肝纤维化的发生与发展过程[14-16]。TGF-β信号通路是肝纤维化形成过程中最重要的信号通路,TGF-β1是目前公认最强的致肝纤维化形成因子,也是最强的促胶原形成因子[17],其在非酒精性脂肪性肝纤维化的发病过程中也发挥着至关重要的作用[18]。这些预测的靶基因参与的信号通路及生物学过程均涉及脂质代谢与肝纤维化等方面,提示miR-150-5p的作用可能与非酒精性脂肪性肝纤维化的发生发展过程相关。
总之,miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中发挥着一定作用,为后续研究miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化中的调控机制提供了一定的数据支持和理论依据。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。