基于高通量测序技术分析七种梨内生细菌多样性

李秋桦，尹 敏，裴 妍，任 禛**，陈泽斌，夏体渊，胡靖祥，徐胜光，陈 秀

(1.昆明学院 农学与生命科学学院，云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明650214；2.云南大学医学院，云南昆明650091)

梨（Pyrusspp.）属于蔷薇科、梨亚科、梨属的植物，具有悠久的种植历史，品种极其丰富.梨果实甘甜爽口，营养价值高，同时还具有药用价值.在医疗功效上，梨可以通便秘，利消化，对心血管也有好处.我国是世界上梨栽培面积最大、产量最多的国家，不仅供应国内，且远销海外[1-2].鉴于梨在我国水果中的重要地位，对其进行生理生长、抗病和抗逆性等方面的研究具有重要意义.植物内生菌是一类广泛存在于植物体内的微生物，具有提高植物抗逆性、促进植物生长以及降低植物病虫害发生等功能，并且在调节宿主体内微生态平衡以及促进宿主植物健康生长等方面亦发挥重要作用[3-6].植物内生菌主要包括细菌、真菌和放线菌，对于梨内生菌的研究报道主要集中在内生细菌方面. 郭志华等[7]从砀山梨中分离筛选出1株对砀山梨胶孢炭疽菌抑菌活性较高的菌株，初步鉴定为枯草芽孢杆菌.谈峰等[8]从浅海水植物中分离出的BR2和BR3两株细菌可以促进杜梨在高盐环境中的存活.于占晶[9]研究发现从黄顶菊中提取的内生细菌对梨黑斑病菌具有拮抗作用.可见，植物内生细菌在促进梨的生长生理、抵抗病害等方面具有重要作用.然而，目前我国关于梨内生细菌多样性的研究几乎为零，这在很大程度上限制了梨内生细菌资源的开发和利用.

高通量测序是目前植物内生细菌多样性研究的主要技术，具有信息量大、重复性好、可靠性高等优点，该技术能更真实地反映样品中内生菌群的组成结构[10-13].本研究为了探明梨内生细菌的类型和分布特征，选取市面常见的7种梨作为研究对象，采用高通量测序法对7种梨内生细菌进行分析，旨在全面揭示不同品种梨内生细菌的多样性，并初步了解梨内具有功能作用的菌株，为后续这些菌株的分离、筛选以及利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 样本采集本研究选取7个不同品种的梨，分别为：河北丰水梨（P1）、云南水晶梨（P2）、云南宝珠梨（P3）、新疆库尔勒香梨（P4）、河北皇冠梨（P5）、安徽砀山梨（P6）、云南雪花梨（P7），具体信息见表1.所有梨样品于2016年8月在昆明超市购买，每个品种随机挑选5个，将购买的梨样品保存于4℃，在12 h内处理.

表1 样品信息Tab.1 Samplesinformation

1.2 表面消毒将不同品种的梨分别用蒸馏水进行多次冲洗，再用70%乙醇浸泡3次，每次浸泡1 min.最后用无菌水冲洗3～4次.在无菌条件下去除梨皮，随后对样品进行DNA提取.

1.3 基因组DNA提取将同一品种不同个体的果肉样品整理为一个样本，并充分混合，共获得7个果肉样本.先将果肉放入液氮中迅速降温，保护DNA不被破坏，然后根据天根植物基因组DNA提取试剂盒说明对样品进行DNA提取.采用1%琼脂糖凝胶检测DNA的质量浓度和纯度，并分别加入超纯水将DNA样品质量浓度稀释到1 ng/μL.

1.4 PCR扩增及高通量测序以7个样品DNA为模板，分别进行16S rRNA基因V4～V5区的PCR扩增，上游引物和下游引物分别为515F（5′-GTGCC AGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCG TCAATT CMTTTRAGTTT-3′），并引入接头.扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，dNTP 4 μL，正反向引物各1μL，DNA模板1μL，Taq酶0.4 μL，补足ddH2O至50 μL.反应程序为：95℃预变性5 min；94℃60 s，56℃60 s，72℃90 s，循环30次；最后在72℃延伸10 min.获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海吉美生物公司进行高通量测序. 使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit建库，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序.

1.5 数据处理运用fastp软件对原始测序序列进行质控；应用FLASH软件进行拼接；使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体；利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释；应用mothur软件计算不同随机抽样下群落alpha多样性，采用R语言工具制作Shannon指数稀释曲线和Rank abundance曲线；使用Excel2003软件对各分类单元数据进行绘图；基于欧式距离（OTU丰度表）的主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）用以展示群落结构差异.

1.6 序列登录所有经过重组和筛选的原始序列都存储在NCBI SRA数据库中，雪花梨、砀山梨、皇冠梨、库尔勒香梨、宝珠梨、水晶梨和丰水梨的登录号分别为SRR10448413、SRR10448414、SRR10448415、SRR10448416、SRR10448417、SRR 10448418和SRR10448419.

2 结果与分析

2.1 不同品种梨内生细菌OTU及多样性分析7个品种梨产生的原始序列在质控后获得V4～V5区的有效序列总数在30 001～42 255条之间，去除叶绿体和线粒体的序列数量之后，得到的细菌序列数量总数在278～3 854条之间.按照97%相似性，分别聚成33～99个可操作分类单元（OTUs）（表2）.结果发现来自河北的丰水梨和新疆的香梨含有较高的有效序列数，而河北的皇冠梨含有的有效序列数较低.从图1结果可以看出，各梨的OTU稀释性曲线以及Shannon指数稀释性曲线均趋于平坦，同时7个样品的OTU覆盖率高达99%以上（表3），说明所测结果可真实地反映各梨中内生细菌群落的组成.

依据OTU数的结果表明（表2），7个梨品种的OTU数大小呈现P1＞P2＞P5＞P4＞P7＞ P3＞P6.从Rank abundance曲线图（图2）可以看出，河北丰水梨、云南水晶梨、河北皇冠梨的曲线下降平缓，而云南宝珠梨、新疆库尔勒香梨、安徽砀山梨、云南雪花梨的曲线下降较陡.结合2项结果表明，河北丰水梨、云南水晶梨中的内生细菌种类较多，而安徽砀山梨所含有的内生细菌丰富度较低.

多样性指数结果发现，7个梨品种内生细菌的Shannon指数、Simpson指数和Chao指数分别在0.4 81～1.1 54、0.4 52～0.7 30和42.3 33～103.8 75之间，说明不同品种梨内生细菌多样性指数存在一定的差异.综合分析3个多样性指数结果，显示河北丰水梨和云南的水晶梨内生细菌多样性较高，而安徽的砀山梨内生细菌多样性较低，这与OTU和Rank abundance曲线结果相一致.

表2 不同品种梨的OTU数及相关序列指数Tab.2 OTUs and related sequence indexes of different pear varieties

2.2 不同品种梨内生细菌种群归类分析排除不可分类的细菌类型后再进行种群归类，7个不同品种梨所得可分类的OTU序列分属17个细菌门、28个细菌纲、52个细菌目、85个细菌科以及120个细菌属.从表4结果可以看出，不同品种梨的内生细菌在门、纲、目、科和属等分类阶元上的数量明显不同，但在各阶层呈现的规律较为一致，整体表现为P1＞P2＞P5＞P4＞P7＞P3＞P6，这与7个梨品种内生细菌的OTU数结果（表2）指向一致.

图1 不同品种梨内生细菌可操作分类单元（OTU）（A）和Shannon指数稀释曲线（B）Fig.1 Number of OTUs(A)and Shannon index(B)rarefaction curve of bacterial endophyte communities detected of different pear varieties

表3 不同品种梨内生细菌多样性指数和丰富度Tab.3 Endophytic bacterial diversity indexes and richness in different pear varieties

图2 Rank abundance曲线图Fig.2 Rank abundancecurves

表4 不同品种梨内生细菌群落细菌学分类阶层总数Tab.4 Total numbers of bacterial taxa detected in different pear varieties

2.3 不同品种梨内生细菌菌群在门水平上的分析在门水平上（图3），7种梨中占比前十的可归类细菌门依次为：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌（Actinobacteria）、螺旋菌门（Spirochaetae）、酸杆菌门（Acidobacteria）、阴沟单胞菌门（Cloacimonetes）、互养菌门（Synergistetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）. 其中变形菌门（Proteobacteria）是不同品种梨的主要优势门，其数量在7种梨内生细菌中占比为64.7%～90.3%；拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）是次优势门，两者数量分别覆盖了7个品种梨的3.5%～14.7%和2.2%～9.8%.可见，不同优势门细菌在7种梨中的分布特点相似，但其丰度占比不同.此外，个别梨品种中还发现了特有的细菌门，在河北丰水梨中特有的门是Latescibacteria门和绿菌门（Chlorobi），而装甲菌门（Armatimonadetes）是云南水晶梨特有的.

图3 不同品种梨内生细菌群落优势细菌门组成Fig.3 Dominant bacterial phyla detected from endophytic bacterial community in different pear varieties

2.4 不同品种梨内生细菌在纲水平上的分析在纲水平上（图4），7种梨中占比前10的可归类细菌纲依次为：β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）、γ-变形菌（Gammaproteobacteria）、螺旋体纲（Spirochaetes）、梭菌纲（Clostridia）、Negativicutes、酸杆菌纲（Acidobacteria），其中，β-变形菌纲（Betaproteobacteria）是不同品种梨的主要优势纲，其数量在7种梨内生细菌中占比为48.1%～75.9%.α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）和拟杆菌纲（Bacteroidia）为次优势纲，两者数量分别覆盖了7种梨内生细菌的10.4%～30.1%和3.5%～14.7%.从上述结果可以看出，不同梨品种内生细菌的优势纲种类相同，但各优势纲在不同梨品种中内生细菌总量的占比并不相同.此外，在个别梨品种中还发现了特有的细菌纲：Ignavibacteria为河北丰水梨特有的纲；Planctomycetacia、Flavobacteriia和Ardenticatenia为云南水晶梨特有的纲.

图4 不同品种梨内生细菌群落优势细菌纲组成Fig.4 Dominant bacterial classes detected from endophytic bacterial community in different pear varieties

2.5 不同品种梨内生细菌在目水平上分析在目水平上（图5），7种梨中占比前10的可归类细菌目依次为：伯克氏菌目（Burkholderiales）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、拟杆菌目（Bacteroidales）、乳杆菌目（Lactobacillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、螺旋体目（Spirochaetales）、梭菌目（Clostridiales）、芽孢杆菌目（Bacillales）、Selenomonadales、Propionibacteriales，其中伯克氏菌目（Burkholderiales）是不同品种梨的主要优势目，其数量在7种梨内生细菌中占比为47.7 %～75.9 %.同时从图5结果可以看出，7个不同梨品种的次要优势目亦相同，分别为鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和拟杆菌目（Bacteroidales）.螺旋体目（Spirochaetales）的细菌仅存在于河北丰水梨、新疆库尔勒香梨和河北皇冠梨中，其在河北丰水梨的数量明显高于其它两种梨.除安徽砀山梨外，其余6个梨品种中均检测到了Propionibacteriales目的细菌.可见，各优势目在不同梨品种内生细菌的占比存在差异.此外，在2个梨品种的内生细菌中发现了特有的目.其中，在河北丰水梨中共检测到了芽单胞菌目（Gemmatimonadales）、巴斯德氏菌目（Pasteurellales）和互营杆菌目（Syntrophobacterales）等7个特有目，在云南水晶梨中发现了海洋螺菌目（Oceanospirillales）、酸杆菌目（Acidobacteriales）和浮霉菌目（Planctomycetales）等10个特有目，这些目的丰度均较低.

图5 不同品种梨内生细菌群落优势细菌目组成Fig.5 Dominant bacterial orders detected from endophytic bacterial community in different pear varieties

图6 不同品种梨内生细菌群落优势细菌科组成Fig.6 Dominant bacterial families detected from endophytic bacterial community in different pear varieties

2.6 不同品种梨内生细菌在科水平上的分析在科水平上（图6），7种梨中占比前十的可归类细菌科依次为：伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、肠球菌科（Enterococcaceae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、韦荣氏菌科（Veillonellaceae）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、丙酸杆菌科（Propionibacteriaceae）和根瘤菌科（Rhizobiaceae）.其中伯克氏菌科（Burkholderiaceae）是不同品种梨的主要优势科，其数量在7种梨内生细菌中占比为40.6%～65.5%.同时测序结果表明，螺旋体科（Spirochaetaceae）仅在河北丰水梨、新疆库尔勒香梨以及河北皇冠梨中出现，其在河北丰水梨中数量为162，其余2个品种中数量分别为3和8.此外，在河北丰水梨内生细菌中共发现了11个特有科类型，包括氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）、巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）等；在云南水晶梨中发现独有的科有17个，包括红蝽菌科（Coriobacteriaceae）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）、盐单胞菌科（Halomonadaceae）等；在河北皇冠梨中出现独有的科有2个，分别是Christensenellaceae和梭菌科（Clostridiaceae）.

2.7 不同品种梨内生细菌在属水平上的分析在属水平上（图7），7种梨中占比前10的可归类细菌属依次为：劳尔氏菌属（Ralstonia）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、伯克氏菌属（Burkholderia）、普氏菌属（Prevotella）、新鞘脂菌属（Novosphingobium）、肠球菌属（Enterococcus）、Tepidimonas属、代尔夫特菌属（Delftia）、Pelomonas属、芽孢杆菌属（Bacillus）.其中，劳尔氏菌属（Ralstonia）是不同品种梨的主要优势属，其数量在7个梨品种内生细菌中占比为27.5 %～57.6 %.从各优势属在不同梨品种的分布差异来看，除云南宝珠梨外，在其它6个梨品种中均发现Tepidimonas属的细菌类型；在云南雪花梨中未检测到芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌类型，而在其它6种梨中均有发现.可见，7个梨品种内生细菌的优势科类型总体相似，但在不同梨品种中各优势科细菌的占比存在差异.此外，在河北丰水梨、云南水晶梨和河北皇冠梨中发现的特有属分别有15个、22个和6个.

图7 不同品种梨内生细菌群落优势细菌属组成Fig.7 Dominant bacterial genera detected from endophytic bacterial community in different pear varieties

2.8 不同品种梨内生细菌群体聚类分析PCA表明（图8），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的样品差异性贡献率分别达到76.6 6%和22.5 1%，合计为99.1 7%，是差异的主要来源.7个品种梨内生细菌群落的多样性存在差异，在4个象限均有分布；其中P1、P3和P7间内生细菌群落多样性差异较小，分布于第三象限，其菌群种类相似程度较高.

图8 不同品种梨内生细菌群落PCA图Fig.8 The PCA analysis of endophytic bacterial community in different pear varieties

3 讨论

植物内生细菌广泛分布于植物组织和器官中，其种类繁多，在植物的代谢、发育和成熟等方面发挥重要作用[14-15].研究表明，传统的纯培养法所鉴定的微生物仅占环境微生物总数的0.1%～10%[16]，而高通量测序技术能较为全面地覆盖内生微生物群落的信息，并且可准确地反映植物内生微生物的种类组成和真实比例[17].陈泽斌等[18]对玉米内生细菌进行高通量测序分析，检测到以往并没有发现的甲基杆菌属（Methylobacterium）和土地杆菌属（Pedobacter）的内生细菌类型，丰富了植物内生细菌资源.符玉松[19]采用高通量测序技术在菖蒲的根、茎和叶部分别检测到了56个科、17个科和6个科的细菌类型，而采用纯培养法仅在相同组织部位检测到了12个科、11个科和4个科的细菌种类.陈东波等[20]运用高通量法对3种来自西双版纳的有毒植物（八角枫、马缨丹和箭毒木）的内生细菌多样性进行分析，共检测出30个属的放线菌，但通过纯培养法仅分离获得11个属的菌株.可见，高通量法能够克服纯培养技术中的分离难、认知少的不足，目前已成为植物内生细菌多样性研究的主流方法.

本研究利用高通量测序技术对7种不同品种梨的16SrRNA基因V4～V5区进行测序，该区域适用性较广，能够高效地扩增目标区域，是微生物多样性分析优先选择的区域之一[21].结果获得了30 001～42 255条有效序列数，并聚成33～99个OTUs，且7个梨品种内生细菌的Shannon指数、Simpson指数和Chao指数分别在0.481～1.154、0.4 52～0.7 30和42.3 33～103.8 75之间，说明所测定的梨品种含有丰富的内生细菌种类.同时，从不同分类单元的统计结果可以看出，7个梨品种在门、纲、目、科、属水平的最优内生细菌类型相同，但具体占比不同.众多研究表明，内生菌的群落多样性不仅取决于宿主植物本身，还与地理位置、温度变化、光照、雨水、空气湿度等环境因素密切相关，表现出一定的宿主专化性和地域专化性[22].所以，虽然7个梨品种内生细菌的群落结构组成相似，但由于品种差异和种植地环境因素的不同，导致内生细菌多样性特征存在一定的差异.古丽尼沙·沙依木等[23]对来自新疆和吉尔吉斯斯坦的8个苹果树品种的内生细菌进行高通量测序，结果发现不同地区的内生细菌种类不同，且新疆本地品种内生细菌多样性和种类高于吉尔吉斯斯坦苹果品种.刘媛等[24]利用MiSeq高通量测序法在7种棕榈科种子中仅发现了23个相同的OTU，说明棕榈类种子内生细菌组成随种子的不同而不同.屈青松等[25]研究发现，Cedeceasp.菌和Rickettsiasp.菌是安徽蝉花内生细菌的优势菌，而Burkholderiasp.菌和Achromobactersp.菌是浙江蝉花内生细菌的优势菌.因此，品种差异和气候因素可能是导致同种植物不同品种间内生细菌组成结构差异的主要原因.

此外，本研究在7个梨品种中发现多数的优势属细菌类型具有一定的功能作用.其中，鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）都具有促进植物生长、增强植株抗逆性的功能，且芽孢杆菌属是工业用酶的主要生产菌株[26]，而鞘脂单胞菌属细菌在降解环境有毒有害物质方面具有应用价值[23]. 相关报道指出，伯克氏菌属（Burkholderia）对金属Cr和Cu具有耐受性，该属菌株在重金属治理中具有巨大开发潜力[27].新鞘脂菌属（Novosphingobium）具有反硝化作用，可以在污水处理中作为一种贫营养好氧反硝化菌群而被进一步开发利用[28].有研究证实，代尔夫特菌属（Delftia）的细菌能够以丁草胺作为唯一碳源进行生长繁殖，可为治理丁草胺等农药土壤污染提供新思路[29].另外，普氏菌属（Prevotella）是人体肠道的有益代谢菌，肠道中普氏菌属/拟杆菌属的比值越高消化越好[30].可见，在梨的内生细菌中存在着大量的功能菌株，有些菌株可能在促进梨的生长和提高抗逆性方面具有重要作用，有些菌株在工业酶生产、污染修复和人类健康等方面具有一定的应用潜力.

本研究发现，劳尔氏菌属的细菌在7个品种梨中占比均最高.具报道该属中的大多数种是植物病原菌，例如常见的茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum），可以引起烟草青枯病，导致烟草根部腐烂，加剧腐生菌在植物根部的定殖[31]，同时该病害可以与根结线虫病、黑胫病等根茎类病害混合发生，防治难度大[32].此外，在桑树中可以引发桑青枯病，一旦发生便会给蚕桑生产带来巨大损失[33].然而，部分劳尔氏菌属的细菌具有生物降解功能，可通过代谢水杨酸和阿魏酸来解除这两种物质的毒性，这与其它细菌利用酚酸降解酶进行解毒的方式不同[34].目前，在梨的相关报道中并未发现劳尔氏菌属细菌引起的病害，推测在梨组织中劳尔氏菌无致病性或未达到致病条件，也有可能是在梨内部存在抑制该病原菌发病的活性物质，对此假设有待进一步证实.

本研究首次采用高通量测序技术分析了7种梨的内生细菌多样性，发现不同品种的梨含有丰富的内生细菌.实验结果为进一步揭示梨与内生细菌之间的互作关系提供参考依据，为后续从梨内生细菌中筛选具有功能价值的微生物资源奠定基础.