小米糠多酚提取工艺的研究

李晓君 张 梅 张建丰 张红娇 丁东源 谭永兰 渠志灿

(中北大学化学工程与技术学院1，太原 030051)(山西纳安生物科技股份有限公司2，太原 030006)

我国谷子的年种植面积约140万ha，产量450万t。小米糠是谷子加工产生的副产物，年产量约30万t[1]，不仅含有丰富的营养物质，而且富含黄酮、多酚等生物活性物质，有助于延缓衰老[2,3]、预防疾病[4]。目前，小米糠小部分被制成家畜饲料，大部分则直接废弃，不仅造成了环境污染，还造成了资源的浪费[5]，所以开发利用小米糠有着重要的意义和广阔的前景[6,7]。

小米糠的酚类化合物具有很强的抗氧化活性，可有效预防癌症、心血管疾病、阿茨海默病及糖尿病等[8，9]。延莎等[10]研究发现，不同品种小米糠以晋谷21号小米多酚抗氧化能力最强，且多酚含量与抗氧化能力呈显著相关性。山西省沁县为小米的传统种植区，其独特的地理和气候生产的小米品质优良，小米更是当地老百姓的主要收入来源。

本实验以山西省沁县的晋谷21号小米糠为原料，通过比较不同提取方法对小米糠多酚得率的影响，并对优选出的方法采用单因素结合响应面辅助的方法对其提取工艺进行了优化，同时对小米糠提取物的化学成分及抗氧化活性进行了分析和测试，为小米糠的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

小米糠原料采自于山西省沁县，由中北大学生物工程专业实验室提供，小米糠过20目筛后备用。

1.2 主要药品及试剂

石油醚、无水乙醇、甲醇、抗坏血酸，均为分析纯；没食子酸、DPPH标准品。

1.3 主要仪器设备

DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱；SOX406索式粗脂肪提取仪；JH-14-04可见分光光度计；JP-040超声波清洗机； Ultimate3000高分辨质谱；EG823CDA-NR美的微波炉。

1.4 五种方法提取小米糠粗提物中的多酚

1.4.1 脱脂

将小米米糠去杂、磨碎、过筛，称取一定量小米糠粉，按料液比1∶10加入石油醚索式抽提得到小米米糠脱脂产物，4 ℃下储藏备用。

1.4.2 超声波提取法(UE)

称取5 g 脱脂小米糠，按料液比1∶10加入体积分数70%的乙醇，在 50 ℃、300 W 条件下超声波提取40 min。抽滤得到提取液1，准确量取滤液体积，将滤渣按料液比1∶6重新加入体积分数70%的乙醇，超声条件不变，结束后抽滤得提取液2，合并两次提取液，记录提取液总体积。

1.4.3 冷浸提取法(CSE)

小米糠与乙醇混合物(料液比1∶10，下同)在常温条件下浸泡 24 h(每隔30 min摇晃一次锥形瓶，尽量使其完全反应)，其他条件与超声波提取处理相同均为两次提取，下同。

1.4.4 热回流法提取法(HRE)

小米糠与乙醇混合物在80 ℃ 条件下进行热回流提取80 min，其他条件与超声波提取处理相同。

1.4.5 闪式提取法(FE)

小米糠粉碎过80目筛，然后与乙醇混合物以12 000 r/min提取1 min，其他条件与超声波提取处理相同。

1.4.6 微波提取法(ME)

小米糠与乙醇混合物放入微波炉每隔20 s间歇微波提取 1 min，微波功率800 W，其他条件与超声波提取处理相同。

1.4.7 多酚得率的测定

参考何志勇等[11]方法，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线，回归方程为：y=1.313 1x-0.028 5 ，R2=0.996 7，通过标准曲线计算上清液中多酚的含量，实验重复3次。

结合1.4.1，计算多酚得率X：

(1)

式中：Y为提取液中多酚的质量分数/%；V为提取液的总体积/mL；M为小米糠原料的质量/g。

1.4.8 多酚清除DPPH·能力测定

用甲醇将多酚提取物样品稀释至不同浓度，每个浓度的样品取0.3 mL 加入试管中，加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室温避光反应30 min，于518 nm 处测定吸光度值。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH 溶液为空白样品，以VC作为阳性对照，所有实验重复3次。根据式(2)计算 DPPH· 清除率。

(2)

式中：A0为DPPH 空白对照的吸光度值；AS为样品与 DPPH 反应后的吸光度值。

1.5 小米糠多酚提取工艺优化

考虑到超声提取小米糠多酚得率最高且同等条件下抗氧化能力较强，因此选择超声提取进行单因素及响应面优化实验。

1.5.1 单因素实验

称取小米糠 5.0 g 于锥形瓶中，在多组预实验的基础上，选取料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)、颗粒度(10、20、40、60、80 目)、提取温度(20、30、40、50、60 ℃)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、超声功率(180、210、240、270、300 W)、乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)，考察各单因素在超声波辅助提取时对多酚得率的影响。料液比1∶10(g/mL)、颗粒度40目、提取温度50 ℃、提取时间40 min、超声功率240 W、乙醇体积分数70%为每个单因素除自身以外的固定值。

1.5.2 响应面优化

通过单因素实验中各因素对小米糠多酚得率的影响，选取料液比、颗粒度、提取温度、提取时间4种影响较大的因素为自变量，多酚得率为因变量，利用Design-Expert 8.0.6软件设计四因素三水平响应面实验，响应面因素与水平设计见表1。

表1 响应面实验设计表

1.6 小米糠多酚组成分析

1.6.1 色谱条件

色谱柱：Innovation Ultimate C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；进样量2 μL；检测波长325 nm；流动相A水/甲酸=99.5/0.5；流动相B为水/乙腈/甲酸=19.5/80/0.5。

流动相洗脱程序：50 min内B由6%升高至50%；5 min内B由50%降低至6%；6% B维持5 min，共60 min。

1.6.2 质谱条件

离子源(ESI)喷雾电压3 500 V；(-)离子模式扫描；质量扫描范围m/z100～1 000；干燥气和雾化气为氮气；干燥气流9 mL/min；雾化气压力40.0 psi；离子源温度 300 ℃。

1.7 数据处理

所有实验均重复3次，使用Origin2019绘图，使用SPSS22.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 5种提取方法对多酚得率及清除DPPH·能力影响

2.1.1 多酚得率

由图1得出，UE(超声波提取)的得率显著高于其他4种提取方法(P<0.05)；CSE(冷提法)和FE(闪提法)与ME(微波法)和HRE(热回流)比较，多酚得率偏高，且无显著性差异(P>0.05)，原因可能是CSE和FE的提取温度远低于ME和HRE时的提取温度，温度较高会导致多酚类物质受热分解，得率下降。又因UE操作方便，提取条件可控制性强，多酚得率较高，所以选择UE进行实验。

图1 5种提取方法对小米糠多酚得率的影响

2.1.2 DPPH·清除率

由图2可知，其中超声波提取时提取物对DPPH·的清除率在2.5 g/L时可达51.57%，显著高于同等浓度的其他4种方法提取物(P<0.05)，但均低于VC标准物的清除率。且超声波提取的提取物浓度在6.0 g/L时对DPPH·的清除率达到80.45 %，显著高于其他提取物在此浓度时的清除率(P<0.05)，又因超声提取具有操作方便、条件易于控制、节能环保等优点，所以选择超声波提取效果最佳。

图2 5种提取方法对小米糠多酚清除DPPH·的影响

2.2 小米糠多酚提取工艺

2.2.1 单因素实验

由图3可以得出，随着料液比的增大，多酚得率呈现先增后减的趋势，在料液比为1∶10时得率最高，为1.703%，与另外4种料液比多酚得率相比差异显著(P<0.05)；当料液比继续增大时，多酚得率反而降低，这可能由于多酚提取物的氧化导致，料液比1∶12和1∶14相比多酚得率差异不显著。研究表明，提取原料和提取溶剂的浓度梯度是提取物溶出的动力，较大的浓度梯度有助于提取物的溶出，但当此浓度梯度达到一定限度时，继续增加浓度梯度对提取物的溶出反而起抑制作用[12]，因此料液比选择1∶10 g/mL最适宜。

图3 各因素对小米糠多酚得率的影响

随着样品颗粒的减小，多酚得率越无显著性差异，颗粒度为10、80目及20、60目时多酚得率没有显著性差异(P>0.05)，但显著低于颗粒度为40目时的多酚得率(P<0.05)，为1.709%，这可能是因为在一定浓度内，随着样品颗粒的减小，物料与溶剂接触更加充分，从而增加了传质效率，有利于小米糠醇溶性提取物的提取，当样品颗粒继续减小，多酚得率反而降低，这可能是因为样品颗粒过小堵塞滤纸，导致滤液损失，得率降低。因此颗粒度选择40目最适宜。

提取温度是小米糠多酚提取过程中重要的影响因素，在料液比、颗粒度、提取时间、超声功率、乙醇体积分数不变的条件下，多酚得率在一定范围内随温度的升高而增加，但当温度达到50 ℃时，得率达到最高，显著高于其他4个提取温度(P<0.05)，继续升高温度多酚的得率反而下降，可能是由于温度的升高，破坏了多酚的结构，进而导致得率下降，因此提取选择温度选择50 ℃最适宜。

由图3可知，随着提取时间的延长多酚得率先升高后降低。提取时间为40 min时多酚得率显著高于其他提取时间(P<0.05)，为1.766%，当提取时间再增加，多酚得率反而下降，这可能是因为多酚已经完全溶出，提取时间再增长，多酚得率不会再增加，还可能会由于热效应导致其氧化分解成其他物质以至于得率下降，因此提取时间选择40 min最适宜。

由图3可以看出，超声功率对多酚得率的影响较小，表现为曲线平缓，且5个功率下多酚得率并无显著性差异(P>0.05)且5种乙醇体积分数对小米糠多酚得率无显著性影响(P>0.05)。

2.2.2 响应面优化

通过软件计算分析，得到4个实验因素影响1个响应值的数学模拟方程，见表2。

表2 响应面优化实验设计与结果

2.2.2.1 响应因子显著性分析及方程拟合效果分析

对表3中的因子进行回归拟合，得到回归方程：R(%)=1.54-0.026A-0.003B-0.00423C+0.00853D+0.017AB+0.007AC-0.035AD+0.02BC-0.00325BD-0.007CD-0.029A2+0.031B2+0.046C2+0.069D2。

表3 响应面模型回归方程的方差分析

2.2.2.2 交互作用影响结果

由响应面实验分析结果可知，液料比和颗粒度、提取温度、提取时间之间的交互关系非常显著，颗粒度和提取温度、提取时间以及提取温度和提取时间之间的交互交互关系较为显著。4个因素对多酚得率都有一定的影响作用，这与回归方差分析结果相吻合。

2.2.2.3 最优方法验证

获得小米糠多酚超声提取最佳工艺条件为液料比9.83 mL/g、 颗粒度58.46目、提取温度48.20 ℃、提取时间48.05 min，多酚得率为1.742%。考虑到实际应用过程中操作简便，将工艺条件修正为液料比10∶1 mL/g、颗粒度60目、提取温度48 ℃、提取时间48 min，在此最佳条件下，进行3次平行实验验证，得到多酚得率均值为1.726%，与预测值偏差0.91%，表明该模型能较好的预测多酚得率。

2.3 最佳条件下小米糠多酚清除DPPH·能力

如图4所示，最佳工艺条件下提取得到的小米糠多酚清除DPPH·的能力随提物浓度的增加而增大，当提取物浓度为6 g/L时小米糠多酚的清除能力可达82.50%，但显著低于同等浓度下VC的清除率93.26%(P<0.05)，为小米糠的综合开发利用提供了依据。

图4 最佳工艺条件下小米糠多酚清除DPPH·能力

2.4 小米糠多酚组成鉴定结果

通过小米糠多酚化合物的离子流色谱图，采用 HPLC-ESI-MS 进行定性分析，实验质谱分析采用(-)离子模式，各小米米糠多酚化合物的相对分子质量即为质荷比值(m/z)加1，由此得到小米米糠多酚中各化合物的分子量。通过与相关文献报告进行比对，并参考国内外相关文献报道，可初步推断小米糠多酚组成成分。主要峰所对应的质谱图见图5、图6，采用质谱分析方法，通过高分辨质谱拟合的分子式，对其质荷比和分子量进行了测定。

图5 小米糠多酚A物质的质谱

图6 小米糠多酚B物质的质谱图

根据图5、图7可知，物质 A 的保留时间为10.34 min，质荷比(m/z)为329.23，高分辨质谱拟合的分子式为C14H18O9，根据数据库检索和文献报道[13]，推测该化合物为香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。

图7 小米糠多酚液质联用色谱图

根据图6、图7可知，物质B的保留时间为10.78 min，质荷比(m/z)为207.14，高分辨质谱拟合的分子式为C11H12O4，根据数据库检索文献报道[14],推测该化合物为阿魏酸甲酯。

3 结论

5种提取方法中，采用超声提取得到的小米糠多酚得率最高，为1.55%；小米糠多酚浓度为6 g/L时对DPPH·的清除率可达80.45%；通过单因素和响应面优化得到的小米糠多酚最佳提取工艺条件为：液料比10∶1 mL/g、颗粒度60目、提取温度48 ℃、提取时间48 min 、超声功率240 W、乙醇体积分数70%，在此条件下小米糠多酚得率为1.726%，且在多酚浓度为6 g/L时对DPPH·的清除率提高了2.05%；HPLC-ESI-MS结果表明，小米糠多酚中含有香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷和阿魏酸甲酯。小米糠不仅营养丰富，且富含多酚等抗氧化活性物质，具有开发为一种新型抗氧化剂的潜力。