miR-146b对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中ICAM-1表达的调控作用

龙光文,张 谦,杨秀林,吉春玲,董裕康

（贵州省人民医院急诊内科，贵州 贵阳550002）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是重症监护病房患者常见的急性肺损伤并发症，可引起严重的全身炎症并导致多器官功能障碍和高死亡率［1］。目前，开发新的治疗方法加强肺修复仍是治疗该病的关键。微小RNA（microRNAs，miRNAs）作为非编码微小单链RNA分子，参与呼吸系统的疾病进展过程［2］。miR-146b通过抑制MyD88/NF-κB信号通路减轻肺炎患儿肺组织的炎症损伤［3］。miR-146b过度表达可有效改善脂多糖诱导的急性肺损伤［4］，说明miR-146b对不同病因引起的肺组织损伤具有一定的治疗作用。此外，细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）作为一种细胞表面黏附受体，可促进受炎症过程影响的组织中多个效应器/靶细胞相互作用，参与ARDS疾病进程，并在ARDS患者血清中高表达［5］。在ARDS小鼠模型中，抑制ICAM-1表达有助于改善肺部炎 症［6］。研究［7］显示：miR-146抑制 剂对白细 胞 介 素1β（interleukin-1β，IL-1β） 诱 导 的ICAM-1表达具有明显促进作用，说明miR-146对炎症条件下ICAM-1表达具有一定的调控能力，但miR-146b是否通过调控ICAM-1表达缓解ARDS患者肺组织损伤尚未明确。本研究通过过表达miR-146b干预ARDS大鼠，检测其对肺组织中ICAM-1表达水平的影响，探讨miR-146b对ARDS大鼠肺组织损伤的作用，为ARDS的治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器健康雄性8周龄SD大鼠60只，体质量220～250 g，购自贵州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（黔）2018-0001。HEK-293T细胞（美国保藏中心ATCC）。agomir-NC、miR-146b agomir、miR-146b mimic和mimic-NC（广州锐博生物科技有限公司），油酸（湖南长沙恒昌化工有限公司），转染试剂Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司），TRIzol试剂（上海晶抗生物工程有限公司），BCA蛋白质定量检测试剂盒和蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），IL-1β、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），逆转录试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega公司），实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（日本TaKaRa公司），兔抗鼠ICAM-1抗体和GAPDH抗体（英国Abcam公司）。血气分析仪（美国雅培公司），LightCycler480 RT-qPCR仪（瑞士Roche公司），电泳仪（美国Bio-Red公司），低温离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 动物模型构建参考文献［8］的方法，采用尾静脉注射油酸构建ARDS大鼠模型。所有大鼠术前禁食12 h，腹腔注射40 mg·kg－1戊巴比妥麻醉，尾静脉注射0.15 mL·kg－1油酸。6 h后大鼠呼吸频次增加，若动脉血液氧合指数（oxygenation index，OI）＜200 mmHg，则表明造模成功。造模成功24 h后取材，进行各项指标检测。

1.3 实验分组和处理将大鼠分为假手术组、模型组、agomir阴性对照组和miR-146b agomir组。假手术组：大鼠麻醉后，尾静脉注射0.15 mL·kg－1生理盐水；模型组：大鼠麻醉后，尾静脉注射0.15 mL·kg－1油酸；agomir阴性对照组：大鼠麻醉后，在术前1 h，采用微量注射器经颈部气管注射50μL转染复合物agomir-NC，并将大鼠直立旋转，然后进行ARDS造模；miR-146b agomir组：与agomir阴性对照组相似，采用微量注射器经颈部气管注射50μL miR-146b agomir转染复合物，再进行ARDS造模。每组大鼠15只。

1.4 各组大鼠动脉血气指标检测取1 mL大鼠股动脉血，采用血气分析仪检测各组大鼠血氧分压（PaO2）和吸入氧浓度（FiO2），并计算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.5 各组大鼠肺组织湿/干重（W/D）比值检测处死大鼠，开胸切除右肺中叶，称湿重。将切除的组织置于恒温干燥箱中48 h，待组织恒重后，称干重。肺组织W/D比值=湿重/干重。

1.6 ELISA法检测各组大鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-1β、IL-6和TNF-α水平处死大鼠，开胸结扎肺。取预冷的等渗生理盐水分3次灌洗左肺支气管肺泡，依次为2、2和1 mL，直到回收率达到85%以上。采用IL-1β、IL-6和TNF-α水平检测ELISA试剂盒检测各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7 HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态表现处死大鼠，开胸切除右肺后叶，置于4%多聚甲醛中固定后，常规制成肺组织石蜡切片。将石蜡切片干燥、脱蜡后，进行HE染色。滴加适量苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗，采用1%乙醇-盐酸分色30 s，加入伊红染色2 min，蒸馏水冲洗后，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明后，采用中性树胶封固，最后采用光学显微镜观察各组大鼠肺组织病理形态表现。

1.8 RT-qPCR法检测各组大鼠肺组织中miR-146b和ICAM-1 mRNA表达水平取各组大鼠肺左叶部分，采用TRIzol法提取组织中总RNA。根据逆转录试剂盒操作说明将提取的RNA逆转录成cDNA。根据荧光定量试剂盒操作说明，取1μL cDNA为模板进行荧光定量扩增。miR-146b上游引物 为 5′-ATGCGCGCTGAGAACTGAATT-3′，miR-146b下游引物为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ICAM-1上游引物为5′-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3′，下 游 引 物 为5′-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3′；GAPDH上 游引 物 为5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游 引 物 为5′-GGAAGATGGTGATGGG ATT-3′。反应条件：95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、40 s，共40个循环，72℃、1 min。采用2－ΔΔCt法计算大鼠肺组织中miR-146b和ICAM-1 mRNA表达水平。

1.9 Western blotting法检测各组大鼠肺组织中ICAM-1蛋白表达水平取各组大鼠肺左叶部分提取总蛋白。加入1 mL预冷的裂解液，快速匀浆后，4℃、12 000 r·min－1离心3 min。取少量上清液，BCA检测蛋白浓度。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，待完成电泳后，湿转法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride，PVDF）上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，采用含Tween20的Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤3次，再加入一抗ICAM-1（1∶5 000）和GAPDH（1∶2 500），4℃孵育过夜，采用TBST溶液冲洗PVDF膜3次，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，TBST溶液洗涤3次。加入ECL化学发光液进行蛋白条带显像，以GAPDH作内参蛋白，采用Image J软件对蛋白灰度值进行分析，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.10 双荧光素酶报告系统检测miR-146b和ICAM-1的靶向关系采用Targetscan（http：//www.targetscan.org）网站预测miR-146b和ICAM-1的靶向关系和碱基互补序列（3′-UTR）。合成含miR-146b结合位点的ICAM-1 3′-UTR序列，构建野生型ICAM-1 3′-UTR荧光素酶报告基因质粒（WT-ICAM-1）。同时，根据ICAM-1 3′UTR构建突变型ICAM-1 3′UTR荧光素酶报告基因质粒（MUT-ICAM-1）。将人HEK-293T细胞以1×104个/孔接种于96孔板上，达到60%汇合。将WT-ICAM-1和MUT-ICAM-1荧光素酶报告基因质粒分别与miR-146b mimic或mimic NC共转染至HEK-293T细胞中，作为miR-146b mimic组和mimic NC组。转染48 h后收集2组细胞，检测2组HEK-293T细胞中相对荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/肾素荧光素酶活性。1.11 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠动脉PaO2和OI、肺组织W/D比值、肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平、肺组织中miR-146b和ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平以及HEK-293T细胞中相对荧光素酶活性均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠动脉血气指标和肺组织W/D比值与假手术组比较，模型组和agomir阴性对照组大鼠动脉血气PaO2和OI值均明显降低（P＜0.01），肺组织W/D比值明显升高（P＜0.01）；与模型组和agomir阴性对照组比较，miR-146b agomir组大鼠动脉血气PaO2和OI均明显升高（P＜0.01），肺组织W/D比值明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠PaO2、OI和肺组织W/D比值Tab.1 PaO2 and OI and ratios of W/D in lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各组大鼠PaO2、OI和肺组织W/D比值Tab.1 PaO2 and OI and ratios of W/D in lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 compared with sham operation group；△P＜0.01 compared with model group；#P＜0.01 compared with agomir negative control group.

Group Sham operation Model Agomir negative control MiR-146b agomir PaO 2（P/mmHg）102.00±10.00 58.00±7.00*61.00±6.00*75.00±9.00△#OI（P/mmHg）533.00±39.00 312.00±25.00*337.00±41.00*465.00±27.00△#Ratio of W/D 3.82±0.41 6.35±0.28*6.47±0.52*4.56±0.65△#

2.2 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平与假手术组比较，模型组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组和agomir阴性对照组比较，miR-146b agomir组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

2.3 各组大鼠肺组织病理形态表现假手术组大鼠肺组织无明显损伤。模型组和agomir阴性对照组大鼠肺组织结构损坏，肺泡腔出血，肺泡壁增厚，嗜中性粒细胞聚集，红细胞渗出。与模型组和agomir阴性对照组比较，miR-146b agomir组大鼠的肺损伤情况得到明显缓解。见图1。

2.4 各组大鼠肺组织中miR-146b和ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠肺组织中miR-146b表达水平明显降低（P＜0.01），ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组和agomir阴性对照组比较，miR-146b agomir组大鼠肺组织中miR-146b表达水平明显升高（P＜0.05），ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）。见图2～4。

表2 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.2 IL-1β,IL-6,and T NF-αlevels in BALF of rats in various groups [n=5，±s,ρB/(ng·L−1）]

表2 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.2 IL-1β,IL-6,and T NF-αlevels in BALF of rats in various groups [n=5，±s,ρB/(ng·L−1）]

*P＜0.01 compared with sham operation group；△P＜0.01 compared with model group；#P＜0.05，##P＜0.01 compared with agomir negative control group.

Group Sham operation Model Agomir negative control MiR-146b agomir IL-1β 35.06±7.54 71.32±8.43*71.60±6.11*50.08±5.29△##IL-6 41.28±4.92 63.07±5.88*62.84±6.01*53.93±5.14△#TNF-α 60.12±6.83 113.58±10.20*109.64±11.36*81.05±7.55△##

图1 各组大鼠肺组织病理形态表现（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of rats in various groups（HE，×200）

图2 各组大鼠肺组织中miR-146b和ICAM-1 mRNA表达水平Fig.2 Expression levels of miR-146b and ICAM-1 mRNA in lung tissue of rats in various groups

2.5 miR-146b和ICAM-1的靶向关系根据Targetscan预测的miR-146b-3p与ICAM-1基因3′-UTR区的靶向结合位点，采用双荧光素酶基因报告系统验证。在转染了WT-ICAM-1的HEK-293T细胞中，与mimic NC组比较，miR-146b mimic组HEK-293T细胞中的相对荧光素酶活性明显降低（P＜0.01）；而在转染了MUT-ICAM-1的HEK-293T细胞中，与mimic NC组比较，miR-146b mimic组HEK-293T细胞中的相对荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。见图5和6。

3 讨 论

ARDS是一种多因素疾病，能引起危重患者呼吸衰竭，是急性肺损伤的严重表现［9-10］。ARDS可由肺直接或间接损伤引起，包括败血症、肺炎、胃内容物吸入和严重创伤［1］。肺损伤主要由中性粒细胞依赖性损伤肺内皮和上皮细胞屏障引起，以肺水肿、严重通气障碍和肺部炎症为特征［11］。研究［12］显示：在脂多糖诱导的ARDS大鼠中，脂多糖诱发的炎症反应能破坏肺泡腔的上皮细胞和内皮细胞，引起血管内液体渗漏至肺泡腔，诱发肺水肿，导致肺泡与血管之间的气体交换障碍，最终导致呼吸衰竭。本研究结果表明：与假手术组大鼠比较，尾静脉注射油酸诱导的ARDS大鼠动脉血PaO2和OI均明显降低，肺组织W/D比值、BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高，并且肺组织结构损坏，肺泡壁增厚，大量红细胞渗漏，说明ARDS大鼠模型构建成功。

图3 各组大鼠肺组织中ICAM-1蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of ICAM-1 protein in lung tissue of rats in various groups

图4 各组大鼠肺组织中ICAM-1蛋白表达水平Fig.4 Expression levels of ICAM-1 protein in lung tissue of rats in various groups

图5 miR-146b-3p与ICAM-1基因3′-UTR区的靶向结合位点Fig.5 Targeted binding sites of miR-146b-3p and 3′-UTR region of ICAM-1 gene

图6 转染WT-ICAM-1和MUT-ICAM-1的HEK-293T细胞中相对荧光素酶活性Fig.6 Relative luciferase activities of HEK-293T cells after transfected with WT-ICAM-1 and MUTICAM-1

miR-146b是miR-146家族的一员，位于人类染色体10q24.32上。研究［13-15］显示：miR-146b高度参与炎症调节。miR-146b在脓毒症ARDS患者中异常低表达，且是独立预测ARDS的危险性的关键因子，可作为脓毒症ARDS预防和预后判断的潜在生物标志物［16］。miR-146b-3p过表达通过抑制PI3K/AKT信号通路降低ARDS小鼠炎症反应，改善脓毒症小鼠ARDS［17］。本研究结果显示：在油酸诱导的ARDS大鼠中，miR-146b异常低表达，miR-146b过表达后，ARDS大鼠的肺损伤情况减轻，BALF中炎症因子水平均明显降低，说明miR-146b对油酸诱导的ARDS大鼠也具有肺保护作用，提示miR-146b可能通过抑制炎症反应缓解油酸诱导的ARDS肺损伤，但其分子机制尚不清楚。

ICAM-1是一种细胞表面糖蛋白，在中性粒细胞流入肺组织的过程中起重要调控作用。在TNF-α的刺激下，ICAM-1基因敲除小鼠肺血管通透性和中性粒细胞计数均降低70%以上［18］。此外，阻断肺组织中ICAM-1的表达可以通过减少中性粒细胞、降低微血管通透性，进而减轻饮食低胆碱/乙硫氨酸诱导的胰腺炎肺损伤［19］。ICAM-1在肝切除术后的肝再生过程中可诱导促炎因子IL-6和TNF-α的产生［20］，上述研究表明：ICAM-1高度参与机体炎症因子的调控，并与炎症因子诱导的肺损伤有关。另外，抑制ICAM-1有助于保护肺微血管内皮屏障对抗LPS诱导的ARDS［21］，表明ICAM-1也是一种用于评估ARDS严重程度和预后的生物标志物。本研究结果显示：ARDS大鼠肺组织中ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平明显升高，经miR-146b过表达干预后，ARDS大鼠肺组织中ICAM-1表达水平明显降低。关于miR-146b和ICAM-1的研究［7］显示：抑制miR-146表达能明显促进炎症因子诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1蛋白表达，说明在炎症条件下，miR-146与ICAM-1的表达呈负相关关系。为了验证两者的作用关系，本研究采用双荧光素酶基因报告系统验证了miR-146b能靶向负调控ICAM-1基因，说明miR-146b可能通过靶向负调控ICAM-1的表达，进而有效缓解ARDS大鼠肺损伤。

综上所述，miR-146b过表达可通过靶向下调ICAM-1的表达抑制炎症因子的表达水平，减轻ARDS大鼠肺损伤，本研究结果初步阐明miR-146b/ICAM-1信号转导可能是ARDS肺损伤进展过程中的重要途径之一。后续将进一步研究miR-146b/ICAM-1与上下游关键因子之间的相互作用，以充分阐明miR-146b/ICAM-1在ARDS中的具体作用机制。