红景天苷对哮喘模型小鼠气道炎症的抑制作用及其机制

栾 雪,延光海,李海波,张 波,张 巍,黄园园

（1.吉林大学第一医院儿科，吉林 长春130021；2.吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向重点实验室，

吉林 延吉133002；3.吉林省长春市儿童医院健康管理中心，吉林 长春130051）

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，以气流的可逆性受限为特征，肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和气道上皮细胞等细胞及其组分参与其中，哮喘发病机制极为复杂［1-2］。目前，炎症反应被认为在哮喘的发生发展过程中起重要作用，抑制炎症反应是治疗哮喘的主要手段［3］。炎症小体是一类分布于细胞浆中的蛋白复合体，其参与细胞多种功能的调控［4］。由凋亡相关微粒蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）、Caspase-1和NOD样受体家族蛋白3（Nodlike receptor family pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）受体组成［5］，其通过剪切半胱氨酸蛋白酶1前体蛋白（pro-Caspase-1）激活白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）家族细胞因子分泌，参与机体的炎症反应［6］。生理条件下，NLRP3处于自身抑制状态，当受到刺激时，其主要通过溶酶体破坏模式、半通道模式和活性氧模式激活［7］。NLRP3的激活与促炎细胞因子的表达升高有关［8］。研究［9-10］显示：在动物实验中，敲除NLRP3基因的哮喘小鼠气道炎症明显减轻，并且Th2相关细胞因子的产生明显减少。CHEN等［11］研究显示：抑制NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白等炎症因子水平可以减少肾脏中促炎细胞因子的产生，从而起到保护肾脏的作用。因此，NLRP3可能是调控哮喘炎症机制的重要靶标。

红景天苷（salidroside，SAL）是植物红景天的提取物，具有广泛的药用价值，对包括肺在内的多种组织和器官具有抗炎和抗氧化等生物学特性［12-13］。研究［14］显示：在体外实验中，SAL能够降低Th2相关细胞因子表达水平，并且通过下调核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）降低卵清蛋白（ovalbumin，OVA）所致哮喘小鼠气道的炎症反应。CAI等［15］发现：SAL可以通过靶向调节IL-33/ST 2抑制2型固有淋巴样细胞（type 2 innate lymphoid cell，ILC2）介导的气道炎症治疗过敏性哮喘。目前尚无关于SAL在哮喘小鼠模型中对NLRP3炎性小体影响的相关报道。本研究建立OVA诱导的小鼠哮喘模型，探讨SAL对NLRP3炎性小体的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器6～8周龄清洁级BALB/c雌性小鼠50只，体质量（21.0±2.5）g，购于延边大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（吉）2017-0003。SAL购自中国源叶生物科技有限公司，OVA、PMSF和PIRA裂解液购于美国Sigma公司，白细胞介素1β

（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素13（interleukin-13，IL-13）、白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）、白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）和白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）ELISA检测试剂盒购自美国Invitrogen公司，NLRP3抗体、ASC抗体、Caspaes-1抗体和IL-1β抗体购自美国Cell Signaling公司，β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。蛋白印迹电泳仪和转膜仪购自美国Bio-Rad公司，酶标分析仪购自南京德铁实验设备有限公司，TXD3台式离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，光学显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 实验动物分组和模型制备将50只BALB/c雌性小鼠于延边大学解剖学教研室动物室内适应性饲养7 d后，随机分为对照组、OVA组、低剂量SAL组、高剂量SAL组和地塞米松组。参照LEE等［16］方法并加以改良制备哮喘模型，即正常小鼠于第1、7和14天腹腔注射混合液200μL（由生理盐水、10 mg OVA和1 mg氢氧化铝组成），第21天时将致敏小鼠置于实验玻璃箱内，采用0.1 g OVA＋10 mL生理盐水雾化的形式激发30 min，共7 d，每日1次。低和高剂量SAL组小鼠在每次激发免疫前1 h分别腹腔注射30和60 mg·kg－1SAL治疗液，地塞米松组小鼠腹腔注射2 mg·kg－1地塞米松治疗液，而对照组小鼠以同等剂量生理盐水代替。

1.3 各组小鼠气道高反应性检测最后1次OVA强化免疫48 h后，将清醒的小鼠置于气压体积描记室，记录3 min内平均基线读数，采用乙酰甲胆碱（2.5～50.0 g·L－1）雾化3 min，记录平均值。根据气道高反应检测仪器的说明书［17］计算增强呼气间歇（enhanced pause，Penh），作为气道缩窄指数反映气道反应性增高的程度。

1.4 各组小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集和细胞计数完成气道反应性的检测后麻醉小鼠，采用1 mL冷PBS液行支气管肺泡灌洗，收集BALF，再将BALF置于4℃、15 000·min－1条 件 下，离 心5 min，上 清 液 于－80℃低温保存，待测细胞因子。沉淀物加入双蒸水200μL定容，采用涂片离心机涂片后，行Diff-quick染色，镜下进行细胞分类计数。BALF中的细胞数由2名独立研究者采用单盲研究确定，并且在显微镜下从3个随机位置分析至少200个细胞。

1.5 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平测定按照ELISA检测试剂盒说明书要求，检测各组小鼠BALF中IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平。

1.6 各组小鼠肺组织形态表现和炎症评分各组小鼠麻醉后取左肺组织，采用甲醛溶液固定后，进行脱水、浸蜡和包埋，将蜡块切成厚度为5μm的切片行HE染色，镜下观察各组小鼠肺组织形态表现以及气道炎症改变。确定炎症评分：无炎症为0分，偶见炎性细胞的浸润为1分，多数支气管或血管表层见1～2个炎性细胞为2分，中层见3～5个炎性细胞为3分，厚层见＞5个炎性细胞为4分。

1.7 各组小鼠肺组织中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平各组小鼠右侧肺组织进行裂解获取蛋白，BCA方法测定蛋白浓度后，每个泳道加入20μg总蛋白，置于12%SDSPAGE胶上90V电压进行电泳，以250 mA电流进行转膜90 min，再采用50 g·L－1脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗，4℃过夜。第2天洗膜后加入相应二抗于室温下孵育1 h。洗膜3次后，加入ECL发光剂显影，在图像分析系统Amersham Imager 600中扫描，进行灰度值检测。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数以及IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平，肺组织中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠气道高反应性水平检测当乙酰甲胆碱剂量增至10.0 g·L－1后，OVA组小鼠气道反应性开始明显增加，当乙酰甲胆碱剂量为50.0 g·L－1时，OVA组小鼠的Penh值明显高于对照组（P＜0.05）。与OVA组比较，高剂量SAL组小鼠Penh值明显降低（P＜0.05），低剂量SAL组小鼠Penh值有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 各组小鼠肺组织病理形态表现与对照组比较，OVA组小鼠可见气道平滑肌增厚，支气管周围和血管周围大量炎症细胞浸润。与OVA组比较，治疗后各剂量SAL组小鼠肺组织炎症细胞浸润明显减少，上述表现得到明显改善。炎症评分结果显示：OVA组小鼠肺组织炎症评分明显高于对照组（P＜0.05）。与OVA组比较，高剂量SAL组小鼠肺组织炎症评分明显降低（P＜0.05）；低剂量SAL组小鼠肺组织炎症评分降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2和3。

2.3 各组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数与对照组比较，OVA组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数均明显增加（P＜0.05）。与OVA组比较，高剂量SAL组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数明显减少（P＜0.05）；低剂量SAL组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

2.4 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平与对照组比较，OVA组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平明显升高（P＜0.05）。与OVA组比较，高剂量SAL组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平降低（P＜0.05）；低剂量SAL组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 各组小鼠气道高反应性的变化趋势图Fig.1 Trend charts of changes in airway hyperresponsiveness of mice in various groups

图2 各组小鼠肺组织形态表现（HE，×100）Fig.2 Morphology of lung tissue of mice in various groups(HE,×100)

图3 各组小鼠肺组织炎症评分Fig.3 Inflammation scores of lung tissue of mice in various groups

2.5 各组小鼠肺组织中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平与对照组比较，OVA组小鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与OVA组比较，高剂量SAL组小鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与OVA组比较，低剂量SAL组小鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图4 各组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数Fig.4 Numbers of eosinophils, neutrophils and lymphocytes in BALF of mice in various groups

3 讨 论

哮喘是一种与气道高反应性相关的慢性炎症性疾病，其特征是反复发作的喘息、胸闷和咳嗽。据估计，到2025年时全球将有4亿人患有哮喘［17-18］。炎症反应在哮喘的发生发展过程中发挥重要作用，是哮喘的可能发生机制之一，即使哮喘临床症状完全消失，气道炎症和气道高反应性依然存在，从而引起临床症状反复发作，导致气道重塑和不可逆的肺功能损害［19-20］。本研究结果显示：SAL能明显降低哮喘小鼠气道阻力，并且对肺内炎症细胞具有抑制作用。同时SAL可以明显降低哮喘小鼠BALF中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数，以及IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33等促炎细胞因子的表达，表明SAL可以抑制哮喘小鼠气道的炎症反应。

表1 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平Tab.1 Levels of IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17A,IL-18,and IL-33 in BALF of mice in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L−1)]

表1 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平Tab.1 Levels of IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17A,IL-18,and IL-33 in BALF of mice in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L−1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with OVA group.

Group Control OVA SAL Low dose High dose Dexamethasone IL-1β 36.38±3.80 73.90±13.85*69.21±14.73 48.24±10.97△41.41±8.78△IL-4 75.44±5.35 255.05±24.16*219.43±21.38 160.46±7.10△110.84±10.65△IL-13 87.57±5.04 295.17±20.64*247.21±12.05 187.02±18.14△142.80±8.41△IL-17A 55.64±8.46 120.36±16.63*103.03±10.16 72.14±11.34△69.28±9.98△IL-18 110.51±7.99 194.92±19.81*161.87±14.95 130.60±13.85△118.66±12.86△IL-33 130.35±7.83 257.40±12.75*222.89±11.01 179.79±11.95△153.34±9.62△

图5 各组小鼠肺组织中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expressions of NLPR3,ASC,Caspase-1,pro-IL-1β,and IL-1βproteins in lung tissue of mice in various groups

NLRP3是炎症小体受体家族成员之一，其主要在中性粒细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和上皮细胞中表达，能够识别各种危险信号，释放细胞因子，诱导炎性细胞的活化。研究［21-23］显示：NLRP3炎性小体的活化能够促进pro-caspase-1转变为caspase-1，促进炎症因子IL-18和IL-1β的释放，引发炎症反应，促进中性粒细胞的募集。NLRP3炎性小体的激活与气道中变应原驱动的炎症反应发生有关。肺部NLRP3炎性小体的激活可通过感染、过敏原和香烟烟雾等空气中的污染物刺激而触发［24］。研究［25］显示：在OVA诱导的急性气道炎症模型中，与对照组比较，缺乏NLRP3炎性小体的小鼠气道中嗜酸性粒细胞数减少、气道高反应性减少、气道炎症程度减轻、杯状细胞聚集减少以及IL-1β表达降低。研究［8，26-27］显示：抑制NLRP3炎性小体的表达，可以抑制气道黏液分泌，减少Th2细胞因子和趋化因子的产生，降低IgE水平。

SAL是草本植物红景天分离提纯后的有效成分之一，具有良好的抗炎和抗氧化特性。研究［28］表明：SAL能阻止迁移-衍生生长因子诱导气道平滑肌细胞中NF-κB信号通路的激活。研究［29-30］显示：SAL通过调节Th1/Th2平衡，从而减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性，具有潜在的临床应用前景。本研究结果显示：SAL能抑制哮喘小鼠气道炎症，并且抑制小鼠肺组织中NLRP3炎性小体的表达水平。上述实验结果表明：SAL能抑制抑制哮喘小鼠的气道炎症反应，并且可能下调NLRP3炎性小体的表达，但具体发生机制仍需今后进一步研究。

综上所述，SAL能明显降低哮喘小鼠气道阻力，并且减轻肺内炎症细胞浸润。SAL可以抑制哮喘小鼠BALF中的炎症细胞和促炎细胞因子的表达，并下调NLRP3炎性小体的表达，从而缓解哮喘小鼠肺组织炎症反应。因此，下调NLRP3炎性小体的表达可能是SAL抑制哮喘小鼠气道炎症的作用机制之一。