红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞凋亡、生长和运动能力的影响

李力，郭祥翠，王倩青，李君，郜智慧

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其死亡率在所有妇科恶性肿瘤中最高。据最新数据统计，卵巢癌占所有女性恶性肿瘤的2.5%以上［1］。由于早期不易被发现，中期发展迅速，晚期难于治疗，卵巢癌病死率逐年递增。目前针对卵巢癌的治疗方法主要有手术、化疗、放疗等，但治疗效果均不理想且有不良反应［2］。红芪是豆科植物多序黄岩芪的干燥根，具有补气升阳、生津养血、排脓托毒等功效，常用于气虚乏力、血虚萎黄、表虚自汗等［3］。红芪多糖是从红芪中提取出的多糖成分，由葡萄糖、木糖、半乳糖等5种单糖构成，因其生物活性丰富、药效强等特点而被广泛应用。研究表明，红芪多糖在多种癌症和炎性疾病中发挥调控作用［4］。但是，红芪多糖在卵巢癌中的研究鲜见报道。本研究旨在探索红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞凋亡、生长和运动的调控作用，为红芪多糖在卵巢癌中的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 红芪多糖（纯度≥90%）购自四川维克奇生物公司（货号：wkq-10046），人卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所，胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司（货号：16141-079），CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物公司（货号：C0037），RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Sigma公司（货号：KK5023），Transwell小室和结晶紫染料购自日本TaKaRa公司，血管内皮生长因子（VEGF）、上皮钙黏蛋白（E-cadherin）和纤维粘连蛋白（FN）兔单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的对应二抗均购自英国Abcam公司，ABI7500 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）；酶标仪（Rayto，RT6100），台式高速离心机（大龙，D3024R），成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R），光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及给药 将卵巢癌SKOV3细胞株置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在5%CO2、37℃培养箱培养至对数生长期备用，参照文献［5］用0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 mg/L红芪多糖培养处理细胞24 h。

1.2.2 CCK-8筛选药物剂量 按照CCK-8试剂盒说明书操作，从0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 mg/L中筛选红芪多糖剂量，在96孔板中接种细胞悬液（100µL/孔），将培养板放入培养箱中预培养24 h（37℃，5%CO2），向每孔加入10µL CCK溶液，用酶标仪测定450 nm处的光密度（OD）。细胞活力=（对照孔OD值－实验孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和白细胞介素（IL）-6的mRNA表达水平 选择对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞株，细胞经不同剂量红芪多糖处理24 h后，用胰酶消化并收集细胞，Trizol试剂盒提取总RNA并测定其浓度和纯度。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，逆转录条件：20℃逆转录15 min，40℃逆转录45 min，90℃灭活2 min。按PCR试剂盒说明书上机实验，PCR热循环参数：95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃30 s，共循环40次。熔解曲线：从60℃开始，每15 s上升0.3℃，直到95℃，循环1次，以β-actin作内参，采用2-ΔΔCt法分析结果。独立重复实验3次，取平均值。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：TNF-α上游5'-AGGCGCTCCCCAAAAAGATG-3'，下游5'-TGGCGGAGAGGAGGCTGACT-3'；iNOS上 游 5'-CCAAGAACGTGTTCACCATG-3'，下 游5'-GATGTCCAG⁃GAAGTAGGTGAGG-3'；IL-6上 游5'-GAGGAGACTTCA⁃CAGAGGATAC-3'，下游5'-GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG-3'；β-actin上 游5'-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3'，下 游5'-CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT-3'。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集卵巢癌SKOV3细胞对数生长期贴壁细胞，用不同剂量红芪多糖处理24 h后，预冷PBS缓冲液漂洗2~3次，流式细胞分选技术将缓冲液重悬，调整细胞浓度至1×106个，加入单克隆抗体并充分混匀，室温避光孵育15 min后，采用BD FACS Aria流式细胞仪进行检测，独立重复实验3次。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞生长 选择0、50、100、200 mg/L红芪多糖给药培养的卵巢癌SKOV3细胞，待细胞生长密度达75%~85%且生长状态良好时，用胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液，细胞计数并取细胞悬液于6孔板中，使每孔细胞数在500~1 000之间，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3 d换液1次，至肉眼可见壁底部形成大小白色斑点时终止培养，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色10~30 min，计算克隆形成率（克隆形成率=克隆数/接种细胞数）。

1.2.6 Transwell检测细胞侵袭 Matrigel胶融化后均匀铺于Transwell小室底层上室中，SKOV3细胞用不含胎牛血清的DMEM培养基培养24 h，使其处于饥饿状态，经胰蛋白酶消化后用DMEM培养基制成细胞悬液，以每孔1×105个细胞加入Transwell小室上室中，下室加入DMEM完全培养基，培养24 h，按1.2.1方法给药培养处理24 h，取出小室，经多聚甲醛固定，结晶紫染色后，显微镜下选取5个不同视野观察并计数（侵袭细胞被染成紫色）。实验重复3次，取平均值。

1.2.7 Western blot检测 选择对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞株，各组用红芪多糖处理24 h后，胰酶消化细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入VEGF（1∶200）、E-cadherin（1∶200）和FN一抗（1∶500），4℃孵育摇床过夜。回收一抗，加入按比例稀释HRP标记的对应二抗（1∶4 000），室温孵育120 min。ECL发光，暗室下曝光显影（ACTIN作内参）。将胶片进行扫描存档，photoshop整理去色，Alpha软件分析OD值。独立实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 使用SPSS 21.0软件分析。正态分布的计量资料以x±s表示。多组数据比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响 不同浓度红芪多糖处理卵巢癌SKOV3细胞24 h后，CCK8检测细胞活力，结果显示，0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800和1600 mg/L红芪多糖处理后，细胞活力分别为（100±4）%、（100±6）%、（99±5）%、（96±7）%、（90±6）%、（83±8）%、（58±7）%、（34±6）%、（17±5）%、（9±4）%和（4±3）%，差异有统计学意义（F=142.880，P＜0.05）。本实验选择0、50、100和200 mg/L红芪多糖进行后续实验。

2.2 红芪多糖对SKOV3细胞TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表达水平的影响 与0 mg/L红芪多糖组相比，50 mg/L红芪多糖组TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表达水平均无明显差异，100 mg/L和200 mg/L红芪多糖组TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表达水平显著下调（P＜0.05），见表1。

Tab.1 The effect of radix hedysari polysaccharide on mRNA levels of TNF-α,iNOS and IL-6 in ovarian cancer SKOV3 cells表1红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞中TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表达水平的影响 （n=3，±s）

Tab.1 The effect of radix hedysari polysaccharide on mRNA levels of TNF-α,iNOS and IL-6 in ovarian cancer SKOV3 cells表1红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞中TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表达水平的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a与0 mg/L红芪多糖组比较，P＜0.05

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2.3 红芪多糖对SKOV3细胞凋亡的影响 0、50、100和200 mg/L红芪多糖组细胞凋亡率分别为（1.51±0.40）%、（1.69±0.50）%、（7.88±1.20）%、（15.62±2.40）%，4组间比较差异有统计学意义（n=3，F=28.103，P＜0.05）。与0 mg/L红芪多糖组相比，50 mg/L红芪多糖组细胞凋亡率无明显差异（P＞0.05），100 mg/L和200 mg/L红芪多糖组细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），见图1。

2.4 红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞克隆形成率的影响 0 mg/L红芪多糖组卵巢癌SKOV3细胞生长

Fig.1 Flow cytometric detection of apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells图1流式细胞术检测卵巢癌SKOV3细胞凋亡率

旺盛，形成的集落形成数较多，50 mg/L红芪多糖组集落形成数略有减少，100和200 mg/L红芪多糖组细胞生长明显被抑制，集落形成数极少。各组细胞克隆形成率分别为（40±8）%、（38±6）%、（15±7）%、（6±4）%。与0 mg/L红芪多糖组相比，50 mg/L红芪多糖组卵巢癌SKOV3细胞克隆形成率无明显差异，100和200 mg/L红芪多糖组卵巢癌SKOV3细胞克隆形成率显著降低（n=3，F=12.308，P＜0.05），见图2。

2.5 红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响 0、50、100、200 mg/L红芪多糖组侵袭细胞数分别 为45.25±7.31、43.12±6.30、25.04±8.11、10.23±4.51个/视野。与0 mg/L红芪多糖组相比，50 mg/L红芪多糖组侵袭细胞数差异无统计学意义，100 mg/L和200 mg/L红芪多糖组细胞侵袭数显著减少（n=3，F=36.324，P＜0.05），见图3。

Fig.2 The growth of ovarian cancer SKOV3 cells detected by clone formation test图2 克隆形成实验检测卵巢癌SKOV3细胞生长

Fig.3 The ovarian cancer SKOV3 cells invasion detected by Transwell assay(×400)图3 Transwell检测卵巢癌SKOV3细胞侵袭（×400）

2.6 红芪多糖对SKOV3细胞VEGF、E-cadherin和FN蛋白表达水平的影响 Western blot结果显示，与0 mg/L红芪多糖组相比，50 mg/L红芪多糖组VEGF、E-cadherin、FN蛋白表达水平无明显差异，100和200 mg/L红芪多糖组E-cadherin蛋白表达水平显著上调，VEGF和FN蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），见图4、表2。

Fig.4 Western blot detection of VEGF,E-cadherin and FN protein expression levels in ovarian cancer SKOV3 cells图4 Western blot检测卵巢癌SKOV3细胞VEGF、E-cadherin和FN表达水平

Tab.2 The effect of radix hedysari polysaccharide on VEGF,E-cadherin and FN protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells表2红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞中VEGF、E-cadherin、FN蛋白表达水平的影响 （n=3，±s）

Tab.2 The effect of radix hedysari polysaccharide on VEGF,E-cadherin and FN protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells表2红芪多糖对卵巢癌SKOV3细胞中VEGF、E-cadherin、FN蛋白表达水平的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a与0 mg/L红芪多糖组相比，P＜0.05

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3 讨论

红芪多糖是红芪的主要活性成分，它具有抗氧化、免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等多种药理作用，如红芪多糖联合甘露糖能抑制肝癌细胞的增殖和运动能力，红芪多糖可诱导肺癌A549细胞凋亡及Bax/Bcl-2表达等［6-7］。本研究结果显示，红芪多糖能抑制卵巢癌SKOV3细胞活力，且红芪多糖剂量越高抑制作用越明显，提示红芪多糖在卵巢癌细胞发生中具有调控作用。

炎性细胞因子是介导炎症反应的重要调节因子，在炎症发生过程中，炎性细胞因子激活并诱导其他炎性细胞释放有害物质，促使细胞坏死或凋亡［8］。TNF-α在卵巢癌细胞中高表达且能促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制卵巢癌细胞凋亡［9］。iNOS是一种同工酶，常作为机体内炎症程度指标，主要分布于内皮细胞、巨噬细胞和神经细胞中。Kielbik等［10］指出，iNOS在卵巢癌细胞中高表达，且与卵巢癌耐药性密切相关。也有研究报道，iNOS通过干扰糖酵解过程，促进卵巢癌细胞增殖和抗氧化能力［11］。IL-6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，可诱导T细胞活化和增殖并促进卵巢癌发生发展［12］。以上研究表明，炎性细胞因子TNF-α、iNOS和IL-6高表达能够促进卵巢癌细胞增殖和迁移能力，抑制细胞凋亡。本研究发现，经红芪多糖处理后，卵巢癌细胞中TNF-α、iNOS和IL-6mRNA表达水平明显下调，红芪多糖能通过下调TNF-α、iNOS和IL-6表达水平，抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖和转移，并促进凋亡。

癌细胞生长和侵袭是卵巢癌细胞扩散的前提，癌细胞生长依赖于肿瘤细胞分化和成熟程度，分化程度越低、成熟度越低的肿瘤细胞恶化的可能性越大。肿瘤细胞侵袭是指细胞通过分泌酶类物质，裂解周围细胞基底膜，从而扩散至其他细胞或组织的过程［13］。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在血管内皮细胞增殖、转移和血管形成中发挥重要调控作用。研究表明，VEGF可促进卵巢癌细胞生长、侵袭和远处转移，并抑制卵巢癌细胞凋亡［14-15］。本研究结果显示，经红芪多糖处理后，卵巢癌细胞中VEGF蛋白表达量明显减少，细胞生长和侵袭能力显著被抑制，提示红芪多糖可通过抑制VEGF蛋白表达降低卵巢癌细胞生长和侵袭能力。

间质转化是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，上皮细胞结构紧密，具有极强的黏附性和细胞极性。而间质细胞则与之相反，细胞之间结构松散，黏附能力极弱，且不具有细胞极性，因此间质细胞具有侵袭和转移能力［16］。E-cadherin是间质转化过程中重要的抑制蛋白，E-cadherin能够增强细胞之间的紧密连接和细胞极性。研究发现，E-cadherin在卵巢癌细胞中异常表达与细胞侵袭和转移密切相关［17-18］。FN是一种高分子糖蛋白，它能够降低细胞之间的黏附性，提高肿瘤细胞侵袭和转移能力［19-20］。本实验中，红芪多糖上调E-cadherin蛋白表达，下调FN蛋白表达，提示红芪多糖可通过调控E-cadherin和FN蛋白表达抑制卵巢癌SKOV3细胞运动能力。

综上所述，红芪多糖能促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡，抑制细胞生长、侵袭和间质转化过程，但其具体的作用机制有待更进一步的研究。