不同图形刺激对小鼠图形视觉诱发电位的影响

王珏，马博文，张伟，史学锋

视觉诱发电位（visual evoked potentials，VEP）是从视皮层脑电活动中提取的视觉刺激诱发的电生理信号，反映视觉通路功能的完整性，是一种客观、有效的检查方法，可为视觉系统疾病的诊断提供重要依据［1-2］。其刺激模式主要包括图形刺激和闪光刺激，常用的图形刺激主要有翻转棋盘方格刺激和光栅刺激。由于闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potential，FVEP）个体间变异较大，一般只在屈光介质透明度差或注视不佳时采用［3］。图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential，PVEP）在波形和时序上的变化较小，因此其在眼科临床检查中常作为首选。临床检查通常使用翻转棋盘方格刺激来评估患者的视觉功能［4-5］。然而，在动物电生理研究方面，国际临床视觉电生理协会（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）尚未出台相应标准［3］，翻转棋盘方格［6-7］、水平［8-9］或垂直［10］光栅图形都可被用来评估动物的视觉功能。小鼠的基因序列与人类具有高度相似性，已成为眼科与视觉科学研究中最常用的模式动物。然而，相比于体积较大的动物，要在小鼠上记录到稳定的PVEP波形较为困难，并且不同的图形刺激在小鼠PVEP检测中是否存在差异，哪种刺激更具有优势，鲜见详细报道。本研究采用脑表面埋置电极的记录方法，获得了高质量的小鼠PVEP结果，分析了水平光栅刺激、垂直光栅刺激和翻转棋盘方格刺激在小鼠PVEP检测方面的具体差异，以期为更好地开展眼科与视觉科学相关研究提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 材料 22只6周龄SPF级C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量16～20 g，均为雄性，屈光间质清晰透明无病变。饲养环境通风良好，温度18～26℃，12 h/12 h明暗交替环境下饲养，饲养条件符合医学实验动物饲养要求（伦理审查编号：IRM-DWLL-2020124）。

1.2 方法

1.2.1 电极埋置 小鼠行5%水合氯醛腹腔注射（10µL/g）麻醉后，将其头部固定于立体定位仪上，双眼涂眼膏或硅油保持角膜湿润。手术过程中，使用不透明黑布遮盖双眼防止显微镜灯光照射损伤小鼠视网膜，术中体温维持在36.5℃。碘伏消毒后剪去小鼠颅骨表面的皮毛，完全暴露颅骨前囟与后囟，清除颅骨表面的皮下筋膜组织。于记录眼对侧初级视皮层双眼区（V1B区）对应位置（后囟旁3 mm）开一直径约1.5 mm的颅窗，暴露硬脑膜。在硬脑膜表面放置自制金属记录电极。于记录眼同侧鼻骨处，采用相同的方法开颅窗并埋置参考电极（图1）。最后用牙科水泥完全覆盖暴露的颅骨。待小鼠在加热毯上苏醒后再将其放回笼中。

Fig.1 The implantation of the recording electrode and the reference electrode图1 记录电极与参考电极的埋置

1.2.2 数据采集 于电极埋置术后的第1天，将小鼠麻醉后进行PVEP检查。整个测试过程在小鼠尾部夹捏反应消失的情况下进行。若在测试过程中出现夹捏反应，则追加少量麻醉药并密切观测小鼠的呼吸情况。将预先埋置好的记录电极和参考电极与信号放大器的探头相连接，接地电极（为自制针电极）插入尾根部。刺激屏幕为LCD液晶显示屏，小鼠双眼正对刺激屏幕，距离屏幕15 cm。实验中使用的水平光栅刺激图形、垂直光栅刺激图形和棋盘方格刺激图形（图2）的空间频率、时间频率、叠加次数等保持一致，空间频率保持0.02周/度，时间频率1 Hz，叠加次数240次，屏幕亮度为20坎德拉/平方米（cd/m2），对比度为95%。每种刺激无时间间隔连续呈现240次，相邻的2次刺激间在空间相位上以180°翻转，不同种刺激间间隔10 s，3种刺激按照事先设定的假随机顺序依次呈现，每只小鼠按随机方法分配不同的假随机刺激顺序。所有小鼠均在麻醉后相同时间开始进行测试，并进行相同时长的测试。视觉诱发电位信号通过CED1401数据采集系统（英国Cambridge Electronic Design公司）和Spike2软件（英国Cambridge Electronic Design公司）采集并保存于电脑中。视觉刺激的显示及数据的采集通过自编的Matlab程序进行控制。所有数据采集均在暗环境中进行，每次记录的环境亮度均保持一致。

Fig.2 The 3 different stimulus patterns图2 3种不同的刺激图形

1.2.3 数据处理 将采集到的数据文件导入Matlab，用自编的Matlab程序对获得的视觉诱发电位信号进行平均叠加处理后，分析不同视觉刺激条件下得到的PVEP P100波振幅与峰时值。用变异系数（coefficient of variation，CV）评估3种不同图形刺激诱发的PVEP振幅与峰时值测量的稳定性。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.2.1统计学软件（美国GraphPad Software公司）进行统计分析。数据以均数±标准差（±s）表示。多组配对数据的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠PVEP波形 小鼠PVEP波形以正向波为主，未见到明显的负向波，所获得PVEP波振幅较大，均超过90µV，多数在150µV以上，见图3。

Fig.3 PVEP waveforms of a mouse图3 小鼠PVEP波形图

2.2 3种不同图形刺激诱发的PVEP P100波振幅的比较 翻转棋盘方格刺激后P100波振幅低于水平光栅刺激和垂直光栅刺激，差异有统计学意义（P＜0.01）；水平光栅刺激P100波振幅低于垂直光栅刺激，差异也有统计学意义（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3种不同图形刺激PVEP P100波振幅与峰时值的比较（n=22，±s）

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3种不同图形刺激PVEP P100波振幅与峰时值的比较（n=22，±s）

＊＊P＜0.01；a与水平光栅刺激比较，b与垂直光栅刺激比较，P＜0.05

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2.3 3种不同图形刺激诱发的PVEP P100波峰时值的比较 翻转棋盘方格刺激P100波峰时值长于水平光栅刺激和垂直光栅刺激，差异有统计学意义（P＜0.05），水平光栅刺激后峰时值长于垂直光栅刺激，差异也有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.4 3种不同图形刺激诱发的PVEP P100波振幅和峰时值稳定性的比较 水平光栅刺激、垂直光栅刺激和翻转棋盘方格刺激PVEP振幅的变异系数分别为19.06%、16.82%和22.87%；峰时值变异系数分别为14.16%、12.07%和18.19%。垂直光栅图形刺激诱发的PVEP振幅和峰时值的测量结果更为稳定。

3 讨论

VEP在眼科检查中普遍应用，对视觉神经通路疾病的诊断十分重要。其信号来自视皮层，是从视觉刺激诱发的脑电信号中通过信号平均技术提取出来的［11］，反映的是从视网膜神经节细胞到视皮层的视觉功能［12］，是视路功能的客观检查方法。PVEP相对于FVEP结果更为可靠，其波形在个体之间更加稳定与一致［11］，因此临床上对于能够实现PVEP记录的受检者均首选PVEP检查。为了规范VEP的检查和诊断，促进VEP检查在眼科和神经科疾病诊断、鉴别诊断和预后评估中的规范应用，近20年来ISCEV先后发布了关于人VEP检查的标准及更新版本［3］。中华医学会眼科学分会视觉电生理学组也于2020年组织翻译和发表了ISCEV最新版本的临床VEP标准［1-2］。但是，动物的PVEP尚无统一的标准［13-14］，各实验室在动物PVEP的检测中所采用的电极放置、刺激图形等记录方法也不尽相同，同时由于其记录难度较高，限制了PVEP这一客观视功能评估手段在眼科与视觉科学研究中的应用。本研究通过将电极埋置于视皮层硬脑膜表面而不侵入视皮层内的方法记录得到了稳定且高幅值的PVEP反应信号，并比较了不同刺激图形PVEP结果的差异，可为将来小型啮齿类动物PVEP指南的制定提供参考。

小鼠与人类的基因序列具有高度的相似性［15］，且饲养简单、成本较低，广泛适用于生物学研究及眼科与视觉科学研究，特别是C57BL/6J品系及以此为背景的转基因小鼠。由于实验用啮齿类动物一般体型较小，视觉诱发反应信号微弱，参考人的PVEP记录方法直接用于啮齿类动物通常信噪比很低，难以得到高质量的数据，严重影响了相关实验结果的可靠性。本课题组曾采用埋置颅钉的方法，对Wistar大鼠进行PVEP记录，得到了较好的记录结果［16］。然而，C57小鼠体质量仅为Wistar大鼠的1/10，其视觉诱发反应信号相应地更为微弱。笔者尝试采用埋置颅钉的方法对小鼠进行PVEP记录，虽然可以记录到PVEP波形，但信噪比较大鼠明显降低，且个体间变异性较大，部分动物个体甚至无法记录到较高质量的波形。本研究采用改进的电极埋置方法，使记录电极更加贴近脑表面以获取视觉诱发反应的脑电信号。由于记录方法的改进，本实验测得的PVEP振幅均超过90µV，信噪比好，高于目前国际上其他方式记录得到的PVEP振幅［17-18］，且该记录方法不侵入视皮层组织内，更具优越性。此外，在本研究中，3种图形刺激的PVEP波形均以正向波为主，未见明显的负向波，可能与本实验中电极埋置的位置有关。以往研究证实小鼠VEP波形与记录电极的深度有关，在小鼠视皮层浅层记录到的诱发反应主要为正向波，在视皮层深层记录到的诱发反应主要为负向波，而在中间层则记录到双向波形［17］。

视觉系统自视网膜神经节细胞开始至视皮层，各个部位的神经细胞对视觉刺激具有特征选择性［19］。很多视觉细胞对不同方位（orientation）或运动方向（direction）的视觉刺激具有选择性［19-20］。研究发现，视网膜的输出神经元—视网膜神经节细胞，对特定方向的运动图像具有优先反应的特性［20］。总体而言，与垂直方向运动的图像相比，视网膜细胞更偏向于水平方向运动的图像［21］。值得注意的是，水平方向运动的刺激实际相当于垂直光栅的运动。外侧膝状体核对不同运动方向的视觉刺激也具有选择性，雪貂外侧膝状体核内的二连放电神经元细胞对水平方向运动的刺激最为敏感［22］。Salinas等［23］在特定空间频率下记录到视皮层细胞更加偏向于水平方向运动的垂直光栅。此外，Yap等［24］也通过研究发现，无论对视力正常儿童还是患有散光的儿童来说，垂直或斜向光栅刺激比水平光栅刺激更易诱发图形给撤光视觉诱发电位。本研究采用于视皮层表面埋置电极的方法，获得了高质量的PVEP记录数据，并系统地比较了水平光栅刺激、垂直光栅刺激和翻转棋盘方格刺激诱发的PVEP振幅和峰时值的差异，进一步明确了采用垂直光栅刺激相对更易诱发出小鼠PVEP波形，表现为更高的振幅和更短的峰时值。这与既往细胞电生理实验研究和临床研究结果是相一致的。同时，垂直光栅刺激可获得更为稳定的小鼠PVEP波形，其更低的变异度也意味着可显著减少实验所需的样本量。