血氧水平依赖成像联合DTI 应用于早期糖尿病肾病糖肾方疗效评价的初步研究

汪 悦，杨 阳，胡小艳，匡 敏，余 薇，邬颖华

（1.四川省成都市第一人民医院/成都市中西医结合医院影像科，四川 成都 610075；2.成都中药大学，四川 成都 610075；3.四川省成都市第二人民医院影像科，四川 成都 610075）

中医药治疗糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）在改善患者临床症状、延缓肾衰竭方面有独特优势。中药复方糖肾方补气益阴、活血去瘀，能纠正2 型DN 气阴两虚夹瘀证患者的多个代谢途径、减少尿蛋白、改善早期DN 患者的临床症状［1-4］。但目前评价糖肾方疗效的手段还局限于尿蛋白和肾脏病理活检。有学者发现，微量白蛋白尿患者的肾脏大多已发生晚期DN 病理学改变［5］，即尿蛋白可能并不是早期DN 的敏感指标。肾脏活检虽是评价肾脏病理结构损伤的金标准，但其有创性难以让患者广泛接受。血氧水平依赖成像（blood oxygenation level dependent，BOLD）与DTI 是新兴的评价肾脏功能的影像学方法，具有非侵入性、无辐射、无需注射对比剂等特点。本研究应用BOLD 和DTI，对肾功能进行影像学评价，进而评价糖肾方的疗效，为中医药的治疗效果评估提供新的实验依据，同时也拓宽了fMRI 的应用范围。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 35 只SPF 级SD 雄性大鼠，体质量180～200 g，购于成都达硕实验动物有限公司，实验单位使用许可证编号SYXK（川）2015-030。大鼠适应性喂养1 周后，选取5 只作为空白组，予以普通饲料喂养10 周，一次性注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。余30 只大鼠予以高糖高脂饲料，饲养10 周后，腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）溶液（剂量40 mg/kg体质量），诱导糖尿病模型。72 h 后至少连续3 次空腹血糖值≥16.7 mmol/L，即视为糖尿病模型造模成功［6］；再持续监测模型大鼠空腹血糖2 周，高血糖（≥16.7 mmol/L）状态稳定者纳入实验。造模成功的24 只大鼠随机分为糖肾方组、模型组各12 只，最终糖肾方组存活9 只、模型组8 只。

1.2 实验室检查与病理学检查 糖肾方组采用糖肾方煎剂灌胃，剂量3.6 g/kg 体质量。糖肾方煎剂由黄芪30 g、鬼箭羽15 g、地黄12 g、枳壳12 g、山茱萸9 g、大黄6 g、三七3 g 组成，煎制成含生药0.36 g/mL 的药液，4 ℃保存。空白组和模型组均采用等体积的蒸馏水灌胃，连续干预6 周。

每周末，大鼠禁食不禁水12 h，测量其体质量，并用血糖仪取尾尖静脉血测空腹血糖。在中药治疗第0、2、4 周末分别将大鼠放入代谢笼，禁食不禁水，收集其24 h 尿液，记录尿量并测定24 h 尿蛋白水平。MRI 扫描完成后，处死大鼠，取右肾，去除包膜，用4%多聚甲醛固定，随后送检行常规HE 染色和PAS 染色病理检查。结合实验室检查与病理检查，根据国际公认的DN 的Mogensen 分期标准［7］进行病理分期。

1.3 MRI 检查 采用GE 3.0 T MRI 扫描仪，动物线圈。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，用胶带和纱布固定，以肾脏为中心，对3 组大鼠分别行常规MRI T2WI、BOLD、DTI 扫描，扫描参数见表1。

表1 MRI 扫描参数

图像传送至后处理工作站，由2 位经培训的研究生进行盲法阅片。分别在自动拟合生成的T2*灰阶图像和b=0 s/mm2的DTI 图像上，于肾门水平选择无变形、无伪影的层面划定ROI，左右肾脏皮质、髓质分别勾画3 个椭圆形ROI，大小尽量一致，每个ROI≥5 个像素，测得双肾皮质、髓质的横向弛豫率（R2*）值、ADC 值与各向异性分数（fractional anisotropy，FA）值，最后取平均值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0 软件进行分析，计量资料以表示。体质量、尿量符合正态分布且方差齐，组间比较行LSD 检验；血糖，肾皮髓质的R2*值、ADC 值与FA 值不符合正态分布和/或方差不齐，组间比较行Kruskal-Wallis H 检验。肾皮质与对应的髓质R2*值、ADC 值、FA 值不符合正态分布，组内比较行Wilcoxon 符号秩检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况、生化指标（表2～5）实验期间，空白组一般情况良好，生化指标正常。干预第6 周，糖肾方组和模型组大鼠较空白组体质量显著降低（均P＜0.05），空腹血糖显著升高（均P＜0.05）。糖肾方组较模型组的空腹血糖低（P＜0.05）。第4 周时，模型组与糖肾方组尿量、24 h 尿蛋白均较空白组显著升高（均P＜0.05）。

表2 3 组大鼠体质量变化（g，）

表2 3 组大鼠体质量变化（g，）

注：与空白组同一时间相比，a，P＜0.05；b，P＜0.01。造模前：指饮食干预10 周后，注射1%链脲佐菌素溶液前。

2.2 MRI 扫描

2.2.1 常规MRI 表现 3 组大鼠肾脏的R2*伪彩图、ADC 伪彩图、FA 图均观察到肾皮质、髓质分界清楚。R2*伪彩图、FA 图示肾皮质呈蓝色，髓质呈绿色；ADC伪彩图示肾皮质呈绿色，髓质呈蓝色，但3 组间各MRI 图像无明显的肉眼差异（图1）。

2.2.2 3 组BOLD 检查中R2*值比较（表6）模型组与糖肾方组的皮质、髓质R2*值均高于空白组；其中模型组髓质R2*值与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；3 组髓质R2*值与皮质比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2.3 3 组DTI 检查中ADC 值与FA 值比较（表7）模型组的肾皮质ADC 值较空白组高，差异有统计学意义（P＜0.01）；而其髓质FA 值稍低，差异无统计学意义（P＞0.05）。糖肾方组较模型组的肾皮质ADC 值有降低趋势，且髓质FA 值有升高趋势，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

组内比较，3 组髓质FA 值均高于皮质（均P＜0.05）。模型组的肾皮质ADC 值高于髓质（P＜0.05）。

表3 3 组大鼠尿量变化（mL，）

表3 3 组大鼠尿量变化（mL，）

注：与空白组同一时间相比，a，P＜0.01；b，P＜0.05。

表4 3 组大鼠空腹血糖变化（mmol/L，）

表4 3 组大鼠空腹血糖变化（mmol/L，）

注：与空白组同一时间相比，a，P＜0.01，b，P＜0.05。与模型组同一时间相比，c，P＜0.05。

表5 3 组大鼠24 h 尿蛋白定量变化（mg/24 h，）

表5 3 组大鼠24 h 尿蛋白定量变化（mg/24 h，）

注：与空白组同一时间相比，a，P＜0.01。

表6 3 组大鼠肾脏皮质、髓质R2*值比较（）

表6 3 组大鼠肾脏皮质、髓质R2*值比较（）

注：R2*值，横向弛豫率。与模型组相比，a，P＜0.05。

表7 3 组大鼠肾脏皮质、髓质ADC 值与FA 值比较（）

表7 3 组大鼠肾脏皮质、髓质ADC 值与FA 值比较（）

注：FA，各向异性分数。与空白组相比，a，P＜0.01；与同组皮质ADC 值相比，b，P＜0.05；与同组皮质FA 值相比，c，P＜0.05。

2.3 3 组肾脏病理检查 空白组右肾标本均无病理性损伤；模型组与糖肾方组肾小管上皮细胞肿胀，甚至坏死、管腔扩张、肾小管间质结缔组织轻度增生，肾小球基底膜轻度增厚，PAS 阳性物质增多，肾间质炎性细胞浸润等不同程度的病理损伤。根据Mogensen 分期标准，模型组8 只大鼠中6 只为DNⅡ期（75.0%），2 只为Ⅰ期（25.0%）；糖肾方组9 只大鼠中5 只为Ⅱ期（55.6%），4 只为Ⅰ期（44.4%），即模型组与糖肾方组大鼠肾脏均处于早期DN 病理改变（图1）。

图1 空白组、模型组、糖肾方组的横向弛豫率（R2*）伪彩图、ADC 伪彩图、各向异性分数（FA）图、HE 染色图（200 倍）、PAS 染色图（200 倍）。3 组大鼠肾脏的R2*伪彩图、ADC 伪彩图、FA 图均观察到肾皮质、髓质分界清楚。R2*伪彩图、FA 图显示肾皮质为蓝色，髓质绿色；ADC 伪彩图显示肾皮质呈绿色，髓质呈蓝色，但3 组间各MRI 图像无明显的肉眼差异。空白组HE 染色图显示肾小球形态正常，肾小管紧密排列，未见异常。模型组HE 染色图中肾小管上皮细胞肿胀，胞质疏松（黑箭）；少量肾小管上皮细胞坏死，胞核固缩深染或碎裂溶解（红箭）；间质少量结缔组织增生（黄箭）；并伴少量炎性细胞浸润（绿箭）；肾小管管型（蓝箭）；少量肾小管管腔内可见坏死细胞碎片（橙箭）。糖肾方组HE 染色图中肾小动脉周围可见大量炎性细胞灶性浸润（黑箭）。空白组PAS 染色图中肾小球结构正常，毛细血管丛结构清晰，PAS 阳性未见明显增多，基底膜与系膜基质未见明显增多。模型组、糖肾方组PAS 染色图中偶见肾小球PAS 阳性物质增多，基底膜轻微增厚

3 讨论

3.1 BOLD 技术评估糖肾方治疗早期DN 疗效的可行性 多种慢性肾脏疾病的肾脏都具有缺氧表现［8］。BOLD 利用脱氧血红蛋白的顺磁性，通过R2*值反映脱氧血红蛋白的浓度变化。R2*值越高，脱氧血红蛋白的浓度越大，周围组织的氧气分压降低［9］，组织越缺氧。本研究显示，模型组的髓质R2*值高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），这与匡敏等［10］的实验结果一致，表明BOLD 可评价早期DN 大鼠肾的氧合水平。经糖肾方治疗后，糖肾方组的肾髓质R2*值较模型组有下降趋势，表明糖肾方能改善早期DN肾脏缺氧，这与糖肾方组成药物的现代药理学研究相符［11-15］，进一步证实BOLD 评价糖肾方治疗早期DN 的疗效具有一定的可行性。

3.2 DTI 技术评估糖肾方治疗早期DN 疗效的可行性 ADC 值表示水分子弥散的自由性，FA 值表示水分子扩散的各向异性变化。ADC 值越高，表明水分子扩散越自由，反之则越受限；FA 值越高，表明水分子的各向异性越高，反之则越低。肾脏血液灌注高、水液代谢旺盛且高度结构化，使得DTI 成为研究肾脏相关疾病的理想手段之一。

本研究中，空白组大鼠肾脏的皮质FA 值低于髓质值（P＜0.05），与胡小艳等［16-17］的研究结果相符，证实正常肾髓质的FA 值高于皮质，这是因为肾髓质有规律排列形成辐射状的髓襻、集合管和微小血管，各向异性较高，而皮质由杂乱的血管球构成，FA 值较低，故髓质的FA 值大于皮质。病理检查结果显示，模型组肾脏处于DNⅠ、Ⅱ期，发生了肾小管扩张、小管上皮细胞水肿，甚至坏死、间质炎性细胞浸润增生等微观变化，从而抑制水分子运动的FA 值［18-19］。与模型组相比，糖肾方组经糖肾方治疗肾髓质FA 值有上升趋势，提示糖肾方可延缓肾脏病理结构损伤，进而证明DTI 可评价糖肾方在延缓肾脏病理损伤方面的疗效。

本研究显示，模型组较空白组的皮质ADC 值升高（P＜0.01），表明早期DN 肾皮质所含自由水的弥散运动加剧。由于早期DN 肾皮质的血流量较大，形成超滤过状态，经肾小球滤过的原尿增多，肾皮质的灌注量也增多，故水分子的运动更自由，表现为ADC值增大［16］。糖肾方组较模型组皮质ADC 值有降低趋势，提示糖肾方可缓解早期DN 肾脏的高滤过状态。

综上所述，糖肾方治疗早期DN 有一定疗效，可能在改善早期DN 肾脏的缺氧状态和微观病理结构改变方面有一定作用。BOLD 和DTI 可通过评估早期DN 肾脏功能进而评价糖肾方的疗效，且早于尿蛋白及肾脏病理学检查，但仍需扩大样本量进一步研究。