超临界CO2萃取桃金娘果及其挥发性成分研究

银慧慧，冀晓雯，孟 菲，赵 武，姜源明，覃振华，刘 伟

(1. 广西壮族自治区兽医研究所，南宁 530001；2. 广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001； 3. 广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)，隶属于桃金娘科(Mytraceae)，是一种优良的野生药用植物资源，广泛分布于东南亚国家和地区，尤其是中国南部、日本、泰国和越南等地[1-2]，具有清热解毒、收敛止泻、活血止血的功效，临床用于治疗痢疾、肠炎、肝炎等症。桃金娘全株可入药，其不同部位的药用价值已得到越来越多的关注，近年来，也作为饲料添加剂在畜禽养殖中得到了应用。桃金娘果实中富含黄酮、多酚以及多糖等多种活性成分，目前对于桃金娘果的研究主要是在饮料、酿酒和保健品等方面[3-5]。由于中药中挥发油一般具有很好的抗菌活性[6-7]，而有关桃金娘果的提取及其挥发性物质等的相关研究报道甚少。超临界CO2流体萃取技术是利用超临界CO2的特殊溶解能力来进行萃取的一种新型绿色提取技术[8]，由于超临界CO2萃取在萃取过程中无试剂残留，并且CO2在生产过程中能够被循环使用，具有无污染、能耗少、操作简单以及萃取效率高等优点，使其在食品、生物、化工、中草药等研究方面都得到了广泛的应用[9-11]。本研究以桃金娘果为研究对象，应用超临界CO2对桃金娘果进行萃取，同时通过单因素和正交试验优化萃取的最佳工艺，采用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)对萃取物中挥发性成分进行主成分分析，旨在为进一步开发和利用桃金娘奠定理论基础。

1 材料与仪器

1.1材料与试剂 桃金娘果(产地：广西桂平，经广西兽医研究所孙建华研究员鉴定为桃金娘果实)；甲醇、95%乙醇、无水乙醇(分析纯，成都科隆化学品有限公司)；甲醇(色谱级，美国Tedia公司)。

1.2 仪器 Thar-SFE-5000 超临界CO2萃取系统(Waters公司)；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)；F160型粉碎机(北京中兴伟业)；SQP型(精度0.01 mg)电子天平(德国Sartorious公司)；CAP225D型(精度0.1 mg)电子天平(德国Sartorious公司)； Varian 300-MS气相色谱质谱联用仪(美国)；气体CO2(99.99%，购于南宁国信气体有限责任公司)。

2 方 法

2.1 样品预处理 挑选颗粒饱满、无损坏、成熟度一致的桃金娘果，清洗干净，65 ℃下烘干，粉碎后过40目筛，得到桃金娘果粉末，置于-4 ℃密封避光保存备用。

2.2 桃金娘果萃取得率 准确称取50.0 g桃金娘果粉末，用10 mL相应的夹带剂进行浸润后置于萃取釜中进行萃取，萃取完毕，收集萃取粗提液，进行减压干燥后得到样品物质称重，并计算提取得率。

2.3 单因素实验设计 影响超临界CO2萃取的因素主要有不同夹带剂、萃取温度、萃取压力、萃取时间、CO2流量等。本研究分别对夹带剂、萃取温度、萃取压力、萃取时间、CO2流量5个因素进行单因素实验，考察这些因素对桃金娘果萃取物的影响。

实验夹带剂分别选择95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、100%甲醇、60%甲醇；萃取温度分别选择25、30、35、40、45 ℃；CO2流量选择分别为10.5、14、17.5、21 mL/min；萃取压力分别为8、10、12、15 Mpa；萃取时间分别为30、60、90、120、150、180 min。

2.4 正交实验设计 正交实验设计根据单因素实验的结果，以萃取得率为实验的考察指标。从中选择合适的萃取温度、CO2流量、萃取压力、萃取时间进行四因素三水平的正交实验，因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Tab 1 Factors and levels of orthogonal test

2.5 GC-MS分析条件 气相色谱条件：色谱柱：VF-5 ms石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温：40 ℃保持4 min，然后以10 ℃/min的速率升温至160 ℃，维持5 min，再以10 ℃/min的速率升温至200 ℃，维持10 min，再以10 ℃/min的速率升温至280 ℃，维持15 min，。载气：He。载气流速：1 ml/min。进样温度：250 ℃。进样量：1 μL。分流比：40。质谱条件：EI(电子轰击):70 eV，倍增器电压1250 V，扫描质量范围45～500 u。

2.6 化合物鉴定 采用计算机检索各峰相应的质谱图，与NIST08.L、RTLPEST3.L标准质谱数据库匹配，筛选匹配度大于80%化合物，结合人工解析和相关文献报道鉴定化合物，成分定量分析采用峰面积归一化法。

2.7 数据统计分析 采用Excel和SPSS 17.0对实验数据进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 夹带剂的选择 固定萃取温度40 ℃、萃取压力10 Mpa、萃取时间30 min、CO2流量为14 g/min，选择不同的夹带剂对桃金娘果进行萃取，结果如图1所示，当夹带剂为95%乙醇时萃取得率最大，因此,选择95%乙醇作为正交试验萃取的夹带剂。

(萃取条件：萃取温度为40 ℃；CO2流量14 g/min；萃取压力10 Mpa；萃取时间为30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 40 ℃; CO2 flow rate 14 g/min; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)图1 夹带剂的影响Fig 1 Effects of cosolvent

3.1.2 萃取温度的选择 固定萃取的夹带剂为95%乙醇、萃取压力10 Mpa、提取时间30 min、CO2流量14 g/min，考察不同温度对萃取得量的影响。由结果看到(图2)，温度越高萃取得量越低，当温度在35 ℃时，萃取得率最高，这是由于过高的温度使得CO2的密度降低，导致了其溶解能力下降，此外，过高的温度也使得萃取物不稳定，溶解量减少，因此，根据此单因素实验，选择正交实验的萃取温度为30、35、40 ℃。

(萃取条件：CO2 流量14 g/min；萃取压力10 Mpa；萃取时间为30 min)(Extraction conditions: CO2flow rate 14 g/min; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)图2 萃取温度的影响Fig 2 Effects of extraction temperature

3.1.3 CO2流量的选择 固定夹带剂为95%乙醇，采用萃取压力10 Mpa，萃取温度35 ℃，提取时间30 min，分别设置CO2流量在10.5、14、17.5、21 g/min时进行实验，考察CO2流量对萃取量的影响，结果如图3。随着CO2流量的增加，萃取得率增加，当流量超过17.5 g/min后，萃取得率开始减少，这是由于CO2流量增加使得萃取物不能及时分离，部分挥发油可能随CO2流失使提取率降低。因此，根据此单因素实验，选择14、17.5、21 g/min的CO2流量进行正交实验分析。

(萃取条件：萃取温度为35 ℃；萃取压力10 Mpa；萃取时间为30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; extraction pressure 10 MPa; extraction time 30 min)图3 CO2流量的影响Fig 3 Effects of CO2flow rate

3.1.4 萃取压力的选择 萃取压力是影响超临界CO2萃取过程中桃金娘果挥发性物质溶解度的一个重要参数。采用95%乙醇作为夹带剂，在萃取实验温度为35 ℃、CO2流量为17.5 g/min、萃取时间为30 min的条件下，分别测定不同萃取压力下对萃取得率的影响(图4)。由图4显示，萃取得率随着萃取压力的增高而升高，当压力超过10 Mpa时，萃取得率变化不大，甚至有下降的趋势。当增大萃取压力时，使得萃取过程中超临界CO2的密度增加，溶质和溶剂之间的传质效率得到了提高，从而增大了目标萃取物的溶解度，提高了萃取得率。当萃取压力升高到一定程度时，超临界流体的可压缩性小，目标萃取物的萃取率并无明显变化，并且高压力萃取也存在诸多不安全因素。因此，本实验选取萃取压力为8、10、12 Mpa进行正交实验。

(萃取条件：萃取温度为35 ℃；CO2 流量17.5 g/min；萃取时间为30 min)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; CO2 flow rate17.5 g/min; extraction time 30 min)图4 萃取压力的影响Fig 4 Effects of extraction pressure

3.1.5 萃取时间的选择 由图5的结果看到，随着萃取时间的增加，萃取得率不断增高，当萃取时间为150 min后，萃取得率增加缓慢。由于萃取时间越长，CO2流体能够更充分的接触桃金娘果，萃取也就越完全。但当萃取达到一定时间后，萃取得率并无明显变化，此外，萃取时间过长也可能导致部分萃取物不稳定，从而影响提取率，过长时间的萃取还会带来过高的萃取成本。因此，在本实验研究中，根据此单因素实验，选择120、150、180 min萃取时间进行正交实验分析。

(萃取条件：萃取温度为35 ℃；CO2 流量17.5 g/min；萃取压力为10 Mpa)(Extraction conditions: extraction temperature 35 ℃; CO2 flow rate17.5 g/min; extraction pressure 10 MPa)图5 萃取时间的影响Fig 5 Effects of extraction time

3.2 正交实验结果与分析 根据3.1项的单因素试验结果，选定萃取温度、CO2流量、萃取压力、萃取时间进行四因素三水平的正交试验，结果见表2。

表2 正交实验设计结果Tba 2 Result and analysis of orthogonal test

由表2可知，影响桃金娘果中挥发性成分萃取得率最显著的因素是萃取时间，其次为萃取压力、萃取温度、CO2流量，各因素不同水平影响次序为A2>A1>A3，B2>B1>B3，C3>C2>Cl，D2>D3>Dl，A2B2C3D2为极差分析得到的最优萃取条件组合，即萃取温度35 ℃、萃取压力12 Mpa、CO2流量17.5 g/min、萃取150 min，方差分析结果见表3。在本研究优化的工艺条件下对桃金娘果进行3次萃取平行试验，得到萃取物平均萃取得率为10.52%。

表3 方差结果分析Tab 3 The analysis of variance

3.3 桃金娘果萃取物挥发性化合物组成及含量分析 超临界CO2萃取的桃金娘果萃取物经GC-MS分析，挥发性成分离子流图见图6，通过计算机检索，扣除不加样品时出现的杂质峰，共鉴定出20 种可能化合物，定性定量结果见表4，鉴定出的成分占总量的74.56%。其中含量最高的为顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯，占总含量的27.73%。

图6 GC-MS 全扫描总离子流图Fig 6 GC-MS full scan total ion current diagram

由表4可见，桃金娘果中挥发性成分包含有5类物质，主要有烃类7种、酸类4种、酯类4种、醛类4种以及醇类1种。其中相对含量最高的为酯类，占总挥发性成分的34.43%，酸类占22.73%、烃类占9.12%、醇类5.84%、醛类2.44%。酯类棕榈酸乙酯、正己酸乙酯、顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯是分离得到的主要酯类物质，其中顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯含量为27.73%，是总挥发性物质中相对含量最高的物质，这些低酯类物质都存在一定的香气[12]，是桃金娘果萃取物气味的主要来源[13]。桃金娘果中分离到的酸类物质主要为己酸、棕榈酸和亚油酸，其相对含量较高，分别为7.62%、7.76%、6.85%，其中，亚油酸是人和动物必需的一种脂肪酸[14]，具有降血脂、软化血管、降低血压等作用[15]。烃类物质又可分为烷类、萜烯等，从桃金娘果种分离得到的主要萜烯类化合物为(1R)-(+)-α-蒎烯(2.39%)、石竹烯(4.11%)，其中石竹烯是一种食品香料[16]。醇类主要分离到的为β-谷甾醇，相对含量为5.84%，β-谷甾醇广泛存在于植物油、坚果等植物种子中，有降胆固醇、止咳、祛痰及抑制肿瘤和修复组织作用[17]，被较多地应用到医药行业中。醛类物质主要为己醛二乙缩醛，相对含量为1.38%，可用于花香、风信子以及梨香精的调配[18]。超临界CO2萃取桃金娘果得到的主要挥发性成分与梁洁怡等[19]采用乙醚提取桃金娘果挥发油成分相近。

表4 桃金娘果中挥发性物质组成及相对含量Tab 4 Composition of volatile compounds in Rhodomyrtus tomentosa fruit and their relative contents

4 结 论

本研究通过单因素实验对桃金娘果萃取得率进行研究，选择95%乙醇为夹带剂，并确定了萃取温度、萃取压力、萃取时间以及CO2四个主要影响因素，通过四因素三水平的正交实验，优化桃金娘果超临界CO2流体萃取的最佳提取工艺，建立了一种超临界CO2流体萃取桃金娘果的方法。传统的提取方法主要有超声提取、水浴提取、加热回流提取等，但这些方法提取温度较高，很容易让提取物中的挥发性物质流失得不到保留，并且使用乙醚等有机溶剂提取污染较高，而超临界CO2流体萃取能够在低温下萃取桃金娘果，并使得挥发性物质能够最大限度地保留，在整个过程中使用的有机溶剂仅为95%乙醇，在萃取结束后能够进行回收，有机试剂残留少、污染低。

本研究建立的桃金娘果超临界CO2流体萃取法工艺条件稳定，具有较好重现性。得到超临界CO2萃取桃金娘果中挥发性成分的优化工艺条件为萃取压力12 Mpa、萃取温度35 ℃、CO2流量17.5 g/min、萃取时间150 min；此条件下桃金娘果的提取率为10.52%。GC-MS对超临界CO2流体萃取桃金娘果中挥发性成分分离效果较好，共鉴定出20种主要化合物，分别为酯类、酸类、烃类、醇类和醛类，其中酯类顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯含量最高(27.73%)，烃类含量最高为石竹烯(4.11%)，酸类拥有最高含量的物质是棕榈酸(7.76%)。本次研究分析鉴定出只有20种主要化合物，这可能与此次实验的桃金娘采摘时期和产地有关。这些研究结果为进一步探讨野生药用植物资源桃金娘的有效成分及其药理作用提供了理论依据。