药物辅助性犯罪中兽药麻醉剂舒泰的UPLC-MRM-IDA-EPI-MS鉴定

吴小军，董林沛，张云峰，赵 鹏，刘冰洁

(1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.爱博才思亚太应用支持中心，北京 100015)

舒泰是一种宠物临床常见的麻醉剂，它是由唑拉西泮和替来他明1∶1混合而成[1-3]。唑拉西泮是苯二氮卓类镇静剂，具有良好的肌肉松弛和抗惊厥作用；替来他明则是一种分离麻醉剂，止痛作用持久。这两种药物在药物动力学上具有互补作用，常用于小动物的临床麻醉。两个药物的代谢能力有一定差异，唑拉西泮在生物体内的稳定性要强于替来他明，实际检验过程中常常能检测到唑拉西泮，而替来他明的浓度却较低[4]。此药物在动物身上应用广泛，但近年来发现此类药物在刑事犯罪领域的滥用现象时有发生，常见于药物辅助性犯罪如迷奸、麻抢等[5-7]。目前对于唑拉西泮和替来他明的检验主要采用GC-MS法[1, 4]，何思阳等[6]采用GC-QTOF鉴定药物辅助性犯罪案件样品中替来他明和唑拉西泮及其代谢物组分，取得良好的定性效果。气质联用法前处理较为繁琐且灵敏度往往达不到要求。LC-MS法具有前处理简单，灵敏度高等优势，采用LC-MS法检验唑拉西泮和替来他明尚未见报道。由于基质的复杂性,有时候即使使用液质串联四级杆MRM模式也难以避免假阳或假阴误判。本研究在优化前处理的方式的基础上建立了UPLC-MRM-IDA-EPI-MS同时定性、定量检测唑拉西泮、替来他明的检验方法。该方法借助于信息依赖性获取技术(IDA)能将多反应检测(MRM)和增强子离子扫描模式(EPI)相结合[8-12]。不仅能保证在MRM基础上获得高灵敏度的定量结果，同时能借助于线性离子阱的增强子离子扫描技术，获得二级质谱进行定性确证。值得指出的是EPI技术具有离子富集、信号增强的作用，即使在极低含量下也能获得质量较高的二级全谱，为低浓度临界值的定性提供参考。使用本方法对血液中唑拉西泮和替来他明进行定性和定量分析，简便快速，并将定性和定量方法有机结合在一起，可以满足复杂基质中目标物的准确定性和定量分析要求。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、材料 超高效液相色谱-串联四级杆复合线性离子阱质谱(岛津LC-30AC- Scix5500-QTrap)；高速离心机(Thermo-Fisher 台式高速冷冻离心机)；超纯水机(Milli-Q Academic)；高速振荡器(CUTEMIXER CM-1000)

盐酸唑拉西泮(cas：33754-49-3)、盐酸替来他明(cas：14176-50-2)标准物质均购于天津阿尔塔科技有限公司；乙腈(色谱纯Merck)；甲醇(色谱纯Merck)；Prime HLB固相萃取小柱(Waters Oasis)

空白血液(购于北京市复兴医院医院血库)；待测样品：心血、尿液，来自某地公安机关送检样本。

1.2 标准溶液的配置 取唑拉西泮和替来他明标准物质各10 mg，精密称定，用甲醇定容至10 mL，配置成1 mg/mL的混合标准品储备液于4 ℃冰箱保存，再用甲醇稀释至10 μg/mL作为混合标准品使用液。

1.3 样品前处理 取血液(尿液)样品0.5 mL于15 mL离心管中，加入2 mL乙腈，高速震荡10 min，8000 r/min离心10 min，取上层清液过PRIME-HLB固相萃取小柱，收集洗脱液，过0.22 μm有机相滤膜，待测。若检材中药物浓度过高，可用乙腈稀释至线性曲线范围内测定。

1.4 超高效液相色谱条件 色谱柱phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；柱温：40 ℃；流动相A相：乙腈，B相：含0.01%甲酸1 mM甲酸铵水。进样体积3 μL。流速：0.45 mL/min。梯度洗脱程序：0～1 min，5%A相；1～1.1 min，20%A相；1.1～6 min，20%～95%A相；6～8 min，95%A相；8～8.1 min，5%A相；8.1～11 min，5%A相。

1.5 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)；离子源温度：500 ℃；喷雾电压5500 V；气帘气压力35 psi；喷雾器压力50 psi；辅助加热器压力50 psi；扫描模式(MRM-IDA-EPI)，MRM相关参数见表1。IDA采用动态背景扣除；扫描阈值100 cps；EPI源参数与MRM模式一致；碰撞能量CE(35±15eV);扫描范围50～300 Da。

表1 唑拉西泮和替来他明的MRM质谱参数Tab 1 MRM parameters of zolazepam and tiletamine

2 结果与分析

2.1 离子对的获取 采用针泵进样方式，将100 ng/mL的唑拉西泮和替来他明标准品分别注入质谱中，分别采用正、负扫描模式对标准品进行扫描，结果表明在正离子模式下，唑拉西泮和替来他明均有较好的响应。在步进电压为5的碰撞能量下分别对两个化合物的子离子进行扫描，确定各个目标物的特征子离子，并进行去簇电压和碰撞电压的优化，得到一系列离子对，如表2所示。

表2 唑拉西泮和替来他明优化后的备选离子对Tab 2 Alternative ion pairs optimized for zolazepam and tietamine

2.2 离子对的选择及条件优化 离子对的选择原则应该遵循无干扰、信噪比高等原则。采用液相色谱进样，进样浓度为100 ng/mL，使用MRM模式扫描监控各个离子对。如图1中所示唑拉西泮和替来他明的备选离子对均不存在干扰，故选择信噪比最高的离子对作为定量离子，信噪比次之的选作定性离子。筛选后的结果如表1所示。

图1 100 ng/mL 唑拉西泮和替来他明各个离子对的抗干扰及信噪比考察Fig 1 Investigation of anti-interference and signal-to-noise ratio of each ion pair of zolazepam and tiletamine at 100 ng/mL

2.3 基质工作曲线、灵敏度与精密度 采用外标标准曲线法定量。由于不同检材的药物含量差异较大，难以采用一致的内标浓度，需要根据不同的样品设置内标，可操作性差；其次内标物质的选择相对困难，氘代内标较为昂贵，故采用外标法定量分析。分别配置1、5、10、20、50、100 ng/mL的混合标准基质添加溶液，以定量离子对的峰面积(y)对目标物质的质量溶度(x)绘制标准曲线，结果表明两目标物物线性关系良好(R2>0.995)；以定量离子对的10倍信噪比作为方法的定量限(LOQ)，以定性离子对3倍信噪比作为方法的检出限(LOD)。将系列标准溶液中浓度为20 ng/mL的标准溶液，连续进样6次，以峰面积的RSD值计算曲线点的精密度。结果如表3所示。两种药物的线性曲线相关性好，线性范围完全能够满足日常办案要求，对于高浓度药物在检验过程中可以采用溶剂稀释的方式，将药物浓度稀释至线性范围内检验，不仅能满足线性要求，对降低基质效应也有一定作用。

表3 方法的基质工作曲线、灵敏度与精密度Tab 3 calibration curves， sensitivity and precision of the method

2.4 方法的回收率与精密度 选择同一批次的空白血，添加适量的混合标准溶液，配制成3个浓度水平(5、20、50 ng/mL)的待测样品，每个水平3个平行样，使用上述前处理方法处理后，使用基质外标曲线定量。结果如表4所示。各个水平的加标回收率均大于85%，方法稳定性符合要求。

表4 血液中唑拉西泮和替来他明的回收率和精密度Tab 4 Recovery rates and precision of zolazepam and tiletamine in the blood

2.5 EPI数据采集分析 运用MRM-IDA-EPI技术，分别采集了唑拉西泮、替来他明50 ng/mL基质添加的二级质谱图，并将采集到的二级质谱图导入数据库中，用于定性检索。如图2所示，唑拉西泮的两个子离子碎片138、243都是由母离子287碎裂产生，而替来他明的151、179则由母离子224碎裂产生，借助peakview软件可以给两物质的特征离子做碎片归属，进一步提高定性的准确性。

图2 A-唑拉西泮和B-替来他明二级质谱图Fig 2 Full spectrum of A-zolazepam and B-tiletamine

2.6 实际样品检测 2019年黑龙江某地发生一起命案，具嫌疑人供述，其将从兽药店买来的麻醉剂注射进被害人体内，导致被害人死亡。当地公安机关立案侦查后，将检材送至中心要求检验被害人血液和尿液中唑拉西泮和替来他明的含量。

运用上述建立的方法不仅能获得高灵敏度的定量结果，还能借助EPI技术对样本的目标物二级全谱与标准物质的二级全谱进行比对，获得更加准确的定性结果。检验结果如图3～图5、表5所示。

图3 样品总离子流色谱图Fjg 3 Chromatogram of total ion flow of the sample

图4 检材血和检材尿中唑拉西泮的EPI全谱与谱库比对结果Fig 4 Comparison results of EPI full spectrum and spectrum library of zolazepam in blood and urine samples

图5 检材血和检材尿中替来他明的EPI全谱与谱库比对结果Fig 5 Comparison results of EPI full spectrum and library of tiletamine in blood and urine samples

表5 样品定量结果(μg/mL)Tab 5 Quantitative results of samples

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的选择 本研究考察了phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；ACQUITY-UPLC-BEH C18(100×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY-UPLC-HSS-T3(100×2.1 mm，1.8 μm)3种色谱柱，F5色谱柱为五氟苯基色谱柱，该柱对含卤素含苯基及共轭基团的物质有较好的分离能力，而C18和T3色谱柱均为C18的键合相，区别在于T3色谱柱对极性化合物有更好的保留。研究结果表明phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)能够将唑拉西泮和替来他明完全分离且信噪比高，另外两种色谱柱均不能有效分离。根据药物的结构，选择酸性流动相有利于药物电离，但过高的浓度的酸会使得基线噪音升高，研究过程中发现适当增加挥发性盐可以改善峰形，经实验后选择0.01%的甲酸1 mM甲酸铵水-乙腈作为液相流动相。这两种药物出峰时间比较接近，采用梯度洗脱的方式使得两物质更好分离。

3.2 基质效应考察 质谱分析过程中，样品基质中的干扰组分会对目标待测物产生影响，从而产生基质增强或基质抑制效应。本研究中评价基质效应的方法是:基质效应=空白基质配制标准响应值/溶剂配制标准响应值×100%。当基质效应在80%～120%之间时，可用标准曲线定量。当基质效应<80%，为基质抑制效应，当基质效应>120%时，为基质增强效应，此时可考虑用基质标准曲线定量。在检验实践中常通过三个途径来减小基质效应的影响，一是对待测样品的再净化处理，常采用液液萃取或固相萃取的方式，去除样品中的多肽、磷脂、无机盐等干扰因素；二是改变液相分离条件，如改变洗脱强度、液相梯度或pH值等以提高分离度，避免待测组分与基质的共洗脱，使得在分离过程中能够有效避开基质效应区间；三是减少进样量或稀释后进样，基质效应一般伴随着进样载量增加而增加，只要灵敏度在许可的范围内均可通过此途径来减少基质效应的影响。综合上述因素，本研究采用固相萃取的方式来减少基质效应对分析的影响。本研究考察了1、10、50 ng/mL三个浓度梯度的基质效应，固相萃取柱子选择了Waters-PRIME- HLB，该萃取柱吸附剂可以吸附样品中非极性干扰物而不影响目标物的回收率，特别是对于造成基质干扰的脂肪和磷脂，去除效率高达95%以上。研究发现唑拉西泮和替来他明的基质效应均介于90%～105%之间。在实际工作过程中为简化实验步骤可忽略基质效应的影响，采用溶剂标准曲线即可对二者准确定量，但本研究中为提高研究结果可靠性，故采用基质加标方式考察线性关系。

3.3 EPI定性方法的选择 法医毒物分析的检材都是被害人的血、尿、胃内容物，基质比较复杂。使用MRM定性模式，当药物浓度过低时，由于基质的干扰，经常会遇到离子对保留时间漂移、离子强度比例偏差大等问题，MRM定性准确性难以保证。本研究利用Q-TRAP线性离子阱技术，借助于数据依赖性获取技术(IDA)能将多反应检测(MRM)和子离子增强扫描模式(EPI)相结合，在采集MRM离子对时，根据设定好的采集条件能够在相同的时间窗采集到关联的增强子离子碎片全谱信息，为物质的准确定性增加了一个维度。线性离子阱技术具有离子富集的作用，借助于此技术即使在低浓度下，也能打出高质量的二级全谱信息。

法医毒物关注的目标物绝大多数是临床治疗药物、毒品及新精神活性物质，兽用麻醉剂在药物辅助犯罪中并不多见，由于毒物种类非常多，兽用药物很少进入法医毒物分析工作者的视野，当遇到此类药物时往往没有现行有效的检验方法。在本案例所遇到的唑拉西泮和替来他明为兽用麻醉剂舒泰的主要成分，此类药物用于人类麻醉在国内外文献鲜有报道。在动物麻醉实验中为监测其血药浓度，多采用气相色谱-质谱法，该方法定性、定量能力强，但操作繁琐，灵敏度差。在侦办迷奸、麻醉抢劫等案件中发现被害人往往后知后觉，侵害行为发生三五天后才报警，此时被害人体内的药物浓度极低，气相色谱-质谱法的灵敏度已远远达不到检验要求。

宠物用麻醉剂舒泰的主要成分为唑拉西泮和替来他明，二者通常为1∶1混合。从案例中可以看出替来他明的代谢速度比唑拉西泮快，故血中替来他明的浓度低于唑拉西泮，两者都可经尿液排出，替来他明经尿液排泄的速率高于唑拉西泮。因这两种药物的代谢速率较快，在一些药物辅助性犯罪案件的鉴定过程中常因被害人报警不及时，错过最佳的检验时间窗口导致原药在体内检不出，后续研究可关注其代谢物。

本研究所建立的UPLC-MRM-IDA-EPI-MS法兼具定性和定量的功能。EPI增强子离子扫描技术，能够增加定性维度，有效避免假阳性的发生；MRM选择离子监控则使方法具备出色的灵敏度，此方法能够满足办案的需求。