广西犬源H9N2亚型流感病毒分离株的全基因组测序分析及其对小鼠的致病性实验

李三木,孙翔翔,孔子荣,何奇松,马 琳,冯淑萍,杨可妍,曾咏芳,熊 毅,颜健华

H9N2亚型流感病毒属于A型流感病毒，正粘病毒科，基因组分8个节段编码约11种蛋白。H9N2亚型流感病毒首次分离是1966年从意大利的火鸡身上分离出毒株A/Turkey/Wisconsin/1/16[1]，国内在1994年于广东省的鸡群中第一次分离到该亚型[2]。虽然H9N2亚型流感病毒具有低致病性的特点[3-4]，但其宿主范围广，不仅能够侵染禽类、野鸟，还能感染包括猪在内的哺乳动物。相对其他亚型病毒，更容易跨物种在人群中传播[5-6]。流行病学和病毒学证据表明，目前从人身上分离的H9N2病毒都来自禽类，没有发现人传人的病例，并且在基因上与当地家禽中流行的H9N2病毒相似[7-8]。

自然条件下犬不太容易感染上流感病毒，实验也没有发现犬流感的流行[9]，既往有研究中发现，犬能被多种不同亚型的流感病毒所感染，包括H3N8[10]、H3N2[11]、H5N1[12]、H1N1[13]、H5N2[14]等，而且也有研究表明犬对H9N2亚型禽流感病毒易感，并且能够形成种间传播[15-16]，我国养犬人群基数很大，犬作为人类伴侣动物能够与人亲密频繁接触，无疑增加了人感染H9N2流感病毒的风险[17]。对广西犬只尤其是宠物犬中分离出的13株H9N2亚型流感病毒A/Canine/Guangxi/1～13/2011(H9N2)进行分子生物学特性分析，了解分离病毒株的来源和遗传特征，再通过关键位点分析，了解分离毒株的抗原性、耐药性，并选取其中部分毒株进行哺乳动物致病性分析，为广西犬源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据。同时，对防控人兽共患病也具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1试验材料 A/Canine/Guangxi/1～13/2011(H9N2)(后文缩写为Ca/GX/1～13)源自广西各地动物医院以及饲养场采集的犬棉拭子。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通有限公司。SPF BALB/c 雌性小鼠购自广东省医学实验动物中心。病毒总RNA抽提试剂盒、dNTP、反转录酶(AMV)、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自天跟生化科技(北京)有限公司。pMD18-T载体以及DH5α感受态细胞等购自TaKaRa公司。

1.2引物设计与合成 参照GenBank上H9N2的序列，利用Primer 5.0软件设计8对引物扩增H9N2亚型流感病毒基因组各片段。使用Uni12引物进行反转录。所用引物均送TaKaRa公司合成。引物序列见表1。

表1 H9N2亚型流感病毒全基因组扩增的引物

1.3核酸提取、PCR扩增 病毒尿囊液RNA抽提，使用Uni12引物经反转录获得cDNA，接着PCR，退火温度为56 ℃。反应结束后经1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.4目的条带回收与克隆 DNA回收纯化，将回收纯化好的产物与pMD18-T载体连接，转化，菌液涂布到LB固体琼脂培养基培养过夜，挑斑扩培后进行菌液PCR鉴定，抽提阳性质粒送大连TaKaRa公司测序。

1.5病毒基因组测序及分析 利用DNAStar进行序列拼接然后与参考毒株进行同源性比对，MEGA 6.0绘制毒株遗传进化树并分析相关功能位点。

1.6鸡胚半数感染量EID50的测定 根据对分离毒株的序列分析，选取A/Canine/Guangxi/1/2011(H9N2)、A/Canine/Guangxi/4/2011(H9N2)、A/Canine/Guangxi/8/2011(H9N2)和A/Canine/Guangxi/10/2011(H9N2)进行病毒感染实验，毒株Ca/GX/1和Ca/GX/4自健康犬中分离得到，毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10源自流感症状的犬只。经尿囊腔接种10日龄的SPF鸡胚，纯化3代，根据Reed-Muench法计算病毒的鸡胚半数感染量。

1.7小鼠的致病性实验 将6周龄的雌性SPF BALB/c随机分成5组，每组8只。按照106EID50/50 μL的浓度攻毒小鼠，攻毒第3 d，采集3只，其脑、鼻甲、脾、肾、肺用于病毒滴定和组织切片，并观察剩余小鼠至14 d。同时进行小鼠的传代实验，研究H9N2病毒分离株对哺乳动物的适应能力及其与宿主转换事件相关的突变，观察病毒致病性的变化。体重变化率(%)=[(感染后平均体重-感染前平均体重)/感染前平均体重]×100%+100%。动物感染实验均在广西壮族自治区动物疫病预防与控制中心生物安全二级实验室开展，符合生物安全条件。

2 结 果

2.1病毒全基因组的核苷酸同源性及遗传进化分析 13个毒株基因片段的核苷酸同源性为PB1: 99.8%～100%、HA: 99.9%～100%、NA: 99.7%～100%，PB2、PA、NP、M、NS同源性均为100%。HA、NS遗传进化与A/Chicken/Beijing/1/94在同一个分支，属于BJ-like谱系。NA与A/Chicken/HongKong/G9/97在同一个分支，属于G9-like谱系。M与A/Quail/HongKong/G1/97在同一个分支，属于G1-like谱系。NP、PA、PB1基因与A/Chicken/Shanghai/F/98在同一个分支，属于SHF98-like谱系。PB2在遗传学上属于一个新的分支，属于DK/ST/163/2004-like谱系(图1、图2)。内部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通过遗传进化分析发现与2013年在上海、杭州等地从人身上分离到的H7N9毒株关系较近,其氨基酸同源性为M：98.4%～99.6%、NP：98.0%～98.2%、NS：92.9%～93.4%、PA：100%、PB1：100%、PB2：98.9%。

图1 H9N2病毒株的HA基因遗传进化树

图2 H9N2病毒株的NA基因遗传进化树

2.2HA氨基酸关键位点分析 通过氨基酸序列分析发现13株犬源H9N2流感病毒株的HA基因的氨基酸位点均相对保守，226位为亮氨酸(Leu)，具有与SAα-2，6-Gal特异性结合的能力，裂解位点为RSSR↓GLF，位于335和341位之间(表2)。糖基化位点和受体结合位点都较保守，除了313和551位的糖基化位点与参考毒株不一致。抗原表位除234位同参考毒株不同外其他都相对保守。HA基因共发生14个位点的突变，而315位突变可能导致一个潜在糖基化位点的增加。

表2 H9N2流感病毒株HA受体结合相关氨基酸位点及连接肽序列

2.3NA氨基酸关键位点分析 对分离株NA基因进行的氨基酸序列分析发现其基质结合位点同参考毒株一致。抗原位点331位V、367位E、432位K的突变可能导致病毒在耐药性上的差异。NA基因潜在的糖基化位点与参考毒株相比比较保守。红细胞结合位点在367、399、432位点处有变动与参考毒株不一致。

2.4其它氨基酸关键位点分析 分离株M1的氨基酸序列发生多个位点的突变，包括37(A)、46(I)、95(K)、140(A)、187(R)、219(V)、224(N)、242(N)和248(L)，这些位点的突变同2013年杭州分离的毒株A/Hangzhou/1/2013(H7N9)完全一致。M2基因第31位氨基酸位点发生了S到N的突变。其它内部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通过遗传进化分析发现，13株毒株与2013年在上海、杭州等地暴发流感从人类身上分离得到的H7N9病毒株有较近的亲缘关系。

2.5鸡胚半数感染量EID50的测定 EID50通过Reed-Muench公式计算得出，4株H9N2病毒株的EID50结果如表3所示，从数据看出毒株A/Canine/Guangxi/4/2011(H9N2)在SPF鸡胚上较其它毒株有略高的增殖滴度。

表3 广西犬源H9N2亚型流感病毒EID50结果

2.6病毒对小鼠致病性的实验结果 从图3可知对照组小鼠的体重在14 d内持续增加，实验组也都呈增加趋势，除Ca/GX/8组与对照组相比增加幅度相仿，其余增加幅度都较小。未出现小鼠死亡。

图3 小鼠感染后体重变化率

感染3 d后，随机剖杀3只小鼠，组织样品匀浆处理，接种10日龄SPF鸡胚进行病毒滴度实验。4株病毒株攻毒的小鼠中脾脏、脑和肾脏中均无病毒，攻毒小鼠的肺脏和鼻甲骨中可以检测到病毒，但同种亚型的不同毒株之间病毒的复制能力也表现出差异。Ca/GX/10株在肺脏组织和鼻甲骨中显示病毒滴度，且小鼠体重变化最大，体重变化最小的Ca/GX/8株只在鼻甲骨中检测到，而Ca/GX/1和Ca/GX/4未检测到病毒(表4)。

表4 小鼠组织感染的病毒复制滴度(log10TCID50/mL)

对Ca/GX/10毒株感染的小鼠肺部组织样品做组织切片，结果显示与未感染的空白对照组相比，攻毒组小鼠肺组织有明显的炎性细胞渗出和浸润，肺泡壁变厚，有多处的破裂，肺泡形状受到不同程度的破坏，大小不一，形状不规则，见图4。

A为对照组；B为感染组

2.7病毒在小鼠中的传代实验结果 选用Ca/GX/8病毒株感染小鼠，连续4次传代的结果如图5所示，第1次体重持续增加，第2次感染小鼠后观察出现被毛凌乱，精神萎靡，食欲不振等症状，体重较第1次在3 d变缓。第3次感染小鼠后与第2次类似，临床症状更加明显，体重变化小。第4次感染后小鼠体重基本不增加，临床症状明显，出现畏冷、食欲不振、精神萎靡等。

图5 小鼠感染后体重变化情况

经过对4次传代后的病毒基因测序发现，Ca/GX/8毒株PB2基因611和623氨基酸位点发生突变，分别是611位天冬氨酸突变为天冬酰胺、623位由谷氨酸E突变为赖氨酸K；其余基因没有发生变化。

3 讨 论

本实验所用13株H9N2流感病毒株都由采自广西各地区的犬棉拭子中分离得到，表明广西地区的犬只中普遍存在感染H9N2流感病毒的情况，这是世界范围内首次从犬只中分离得到H9N2亚型流感病毒，也表明了该亚型病毒的宿主范围得到进一步扩大。H9N2病毒极易发生跨物种传播，而犬类作为日常伴侣动物能够与人类亲密接触，增加了人类感染H9N2亚型流感病毒的风险。

HA基因源于禽类，为欧亚谱系的BJ-like亚系，基因序列和中国地区的H9N2亚型都与流行代表毒株A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)有较近的关系。氨基酸分析表明HA基因的226位为亮氨酸(Leu)，具有与唾液酸受体SAα-2，6-Gal特异性结合的能力，表明分离得到的H9N2亚型流感病毒虽然来源于禽类，但特异性的结合受体已经具备和人源受体特异性结合的能力，引起哺乳动物的易感[18]。HA基因的裂解位点为RSSR↓GLF，位于335和341位之间。HA1和HA2由两个碱性氨基酸连接，说明分离的毒株为低致病力毒株[19]。HA基因的糖基化位点和受体结合位点都较保守，只有313和551位的糖基化位点与参考毒株不一致。313-315位点位于裂解位点附近，这可能会通过干扰蛋白酶裂解而增强致病性[20]。本研究分离株受体结合位点191位为N、198位为A，与禽源毒株一致，因此可以推断其属于禽源。

NA基因属于欧亚谱系G9-like亚系，典型的禽源特征。13株毒株的抗原位点在331、367、432位点表现与参考毒株不一致，可能导致耐药性的差异。红细胞结合位点在367、399、432位点处与参考毒株不一致，这些位点是NA基因主要抗原位点，神经氨酸酶的唾液酸结合位点易受抗体阳性选择从而进化[21]，推测NA基因氨基酸的变化可能是病毒逃避疫苗作用导致。

M2基因第31位氨基酸位点发生了S到N的突变，此突变导致病毒产生对金刚烷胺类药物的耐药性[22]。M1基因发生了多个氨基酸位点的突变，包括37(A)、46(I)、95(K)、140(A)、187(R)、219(V)、224(N)、242(N)和248(L)，这些突变都与毒株A/Hangzhou/1/2013(H7N9)一致，突变对病毒的影响需要进一步的研究。其它内部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通过遗传进化分析发现，13株毒株与2013年在上海、杭州等地自人流感病毒分离株H7N9有较近的亲缘关系。病毒的致病性以及不同种间传播机制有待进一步研究。

经同源性和系统进化树分析发现，13株病毒株的8个基因片段来源于5个经典毒株。不属于已有基因型A-R的划分[23]，而是一个新的基因型，属于禽源欧亚谱系，这与华南地区的大部分禽源流感病毒一致。说明在华南地区，特别是广西地区，基因型复杂，这可能是由于该地区混合饲养的模式，为病毒基因重组的发生提供了条件。

小鼠的致病性实验中，健康犬中分离得到的毒株Ca/GX/1和Ca/GX/4在小鼠体内尚未有效复制，而源自流感症状的犬只的Ca/GX/8和Ca/GX/10发现可以在小鼠体内发生复制，Ca/GX/10毒株甚至可以出现显著的临床症状如体重下降、精神不振、没有食欲以及被毛凌乱等。组织切片也显示出炎症反应造成的损伤。说明即使同种亚型的不同毒株在对宿主动物的致病力方面也表现出不同。本实验中未出现小鼠死亡，对小鼠表现为低致病力，但不能排除其他重组毒株能够导致宿主严重的损伤甚至死亡[24-26]。氨基酸位点分析，Ca/GX/8和Ca/GX/10完全一致，而Ca/GX/4同其他毒株相比氨基酸位点在PB2基因的296位发生了D到N的突变，Ca/GX/1则有多个位点的突变，HA152K→E，NA380I→T，M2的64S→A、66E→K，PB1的411M→L、422S→L、630P→L和PA210T→I，推测正是由于这些氨基酸位点的突变的综合影响导致Ca/GX/1和Ca/GX/4对小鼠的致病性降低。流感病毒通过基因突变和重组实现对环境的适应[27-28]，经4次传代后的病毒测序发现，Ca/GX/8毒株PB2基因611和623氨基酸位点发生突变，经查阅暂无文献报道这两个氨基酸位点突变有何影响，该突变对病毒致病性的影响还有待进一步的研究。

利益冲突：无