芋螺毒素Lt14a的化学合成和稳定性研究

吴赟，曹锟

（广东医科大学 广东省医学分子诊断重点实验室，广东 东莞 523808）

芋螺是一类海洋无脊椎动物，目前大约发现有700多种[1-2]。芋螺的毒管组织可以产生毒液，以捕获猎物或防御天敌[3-4]。芋螺毒液的主要有效成分是一些通常包括12～50个氨基酸残基和1～5对二硫键的多肽，这些多肽被称为芋螺毒素[5,6]。芋螺毒素是功能多样的分子，可以选择性地靶向不同亚型的神经递质或离子通道受体，通常被用于神经科学研究的分子工具或临床治疗药物[7-8]。芋螺毒素Lt14a（MCPLCKPSCTNC）含有13个氨基酸残基，最早发现于信号芋螺的毒管cDNA文库[9]。在此前的研究中发现，Lt14a可抑制疼痛，并且对人类细胞的毒性很低[10]；Lt14a以神经元烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）为靶点，在被测浓度下不会诱导药物依赖[11]。作为一种潜在的镇痛化合物，目前Lt14a已经进入了临床前研究阶段。为了能够进一步的评价Lt14a的药物性能，本研究合成了连续3个批次的Lt14a，并对样品的稳定性进行了检测。

1 材料与方法

1.1 多肽合成

采用Fmoc法连续合成3批芋螺毒素Lt14a 多肽原料药（样品批号：20190301、20190302、20190303）[12-13]。通过全自动多肽合成仪（JB2014001，海南建邦）进行多肽的合成。从仪器上裂解下来的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下离心10 min。收集沉淀，进行冷冻干燥。取少量冻干后的粗肽溶解，经10 000×g离心2 min去除杂质后，上C18反相柱进行高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC，Agilent 1200，美国安捷伦）检测及纯化。线性梯度洗脱，215 nm和280 nm处双波长检测。将HPLC收集的目标峰取1 μL，进行质谱检测分析。确定多肽分子量正确后，用于后续实验。根据质谱结果，收集HPLC纯化后的目的峰，再次冻干。再经HPLC纯化，经检测达到95%以上纯度后，第3次冻干成粉末，-20 ℃保存备用。

1.2 破坏性试验

1.2.1 酸破坏性试验

取3个批次的Lt14a样品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1HCl 10 mL，振摇后室温放置12 h，过滤，吸取20 μL进样。根据HPLC谱图，分别计算样品和杂质的峰面积。

1.2.2 碱破坏性试验

取3个批次的Lt14a样品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1NaOH 2 mL，振摇后室温放置30 min，过滤，吸取20 μL进样。根据HPLC谱图，分别计算样品和杂质的峰面积。

1.2.3 氧化破坏性试验

取3个批次的Lt14a样品5 mg，各加入10% H2O21 mL，振摇后室温放置30 min，过滤，吸取20 μL进样。根据HPLC谱图，分别计算样品和杂质的峰面积。

1.2.4 光照破坏性试验

取3个批次的Lt14a样品各5 mg，在4 500±500 Lx的光照条件下，在光照培养箱（PGX-280A-12H，宁波莱福）中放置7 d后，加入去离子水10 mL使其溶解并过滤，吸取20 μL进样。根据HPLC谱图，分别计算样品和杂质的峰面积。

1.3 高温高湿稳定性试验

1.3.1 高温稳定性试验

精密称取20190301批次芋螺毒素Lt14a样品15份，每份10 mg，置于洁净并精密称重的西林瓶中摊平，将西林瓶开口置于湿度60%，温度分别为40 ℃和60 ℃的恒温恒湿培养箱（HSP-250B，上海坤天）中，分别于第0、5、10天各取样3份，观察外观，并通过HPLC分析样品含量。

1.3.2 高湿稳定性试验

精密称取20190301批次芋螺毒素Lt14a样品15份，每份10 mg，置于洁净并精密称重的西林瓶中摊平，将西林瓶开口置于为温度25 ℃，湿度分别为75%和90%的恒温恒湿培养箱中，分别于第0、5、10天各取样3份，观察外观，并通过HPLC分析样品含量。

2 结果与讨论

2.1 芋螺毒素Lt14a多肽原料药的合成

采用多肽合成仪合成了3个批次（批号：20190301、20190302、20190303）的芋螺毒素Lt14a，使用HPLC对其进行了纯化，最终Lt14a的样品纯度大于95%；通过质谱鉴定了Lt14a的分子量与预测值相符，可以用于后续试验（图1）。

图1 芋螺毒素Lt14a（20190301批次）的HPLC纯化图（A）和质谱鉴定图（B）

2.2 破坏性试验结果

对3个批次的芋螺毒素Lt14a样品分别进行酸、碱、氧化、光照破坏后，通过HPLC检测破坏性试验结果。将HPLC谱图中的Lt14a样品峰和杂质峰分别统计峰面积和百分率（表1）。从结果统计表中可以看出，经过12 h的酸破坏，共产生了4个杂峰，而Lt14a样品峰面积依然大于88%。但是经过30 min的碱和氧化破坏后，Lt14a样品峰面积只有85%左右。长时间的光照对于Lt14a的影响则不是很大，样品峰面积都大于95%。

表1 芋螺毒素Lt14a的破坏性试验结果

2.3 稳定性试验结果

2.3.1 高温稳定性试验结果

将芋螺毒素Lt14a样品在正常湿度下，分别放置于40 ℃和60 ℃的环境中5 d和10 d之后，观测其外观形状依然保持为白色结晶性粉末，无明显变化。称重后发现，重量略有下降。HPLC检测含量后发现，样品含量有所下降，但是依然大于95%。

表2 芋螺毒素Lt14a的高温稳定性试验结果

2.3.2 高湿稳定性试验结果

将芋螺毒素Lt14a样品在正常温度下，分别放置于湿度为75%和90%的环境中5 d和10 d之后，观测其外观形状依然保持为白色结晶性粉末，无明显变化。称重后发现，重量略有升高。HPLC检测含量后发现，样品含量基本无变化，均大于98%。

表3 芋螺毒素Lt14a的高湿稳定性试验结果

3 结 论

经过以上稳定性试验研究，化学合成的芋螺毒素Lt14a样品在酸性和光照环境下稳定性较好；同时应该避免暴露于碱性和氧化环境下；高温或高湿的环境对Lt14a样品基本无影响。因此，通过化学合成获得的Lt14a样品的稳定性能够满足临床前研究的样品需要。