西藏牦牛源腹泻病原菌的分离鉴定及耐药性研究

2021-06-03张开琴次旺罗杰索朗斯珠

甘肃畜牧兽医 2021年5期

张开琴，王刚，穷珍，巴桑，次旺罗杰，石次，索朗斯珠

（西藏农牧学院动物科学学院西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室，西藏林芝 860000）

牦牛是高寒地区的特有牛种，草食性反刍家畜，常见于西藏、青海等高寒高海拔地区，以前被农牧民作为劳役劳动力使用，其饲养模式多为放牧散养和部分半舍式饲养[1]。牦牛大肠杆菌病是由大肠杆菌感染牦牛引起的一种以腹泻、败血症为主要特征的急性传染病，在西藏牧区流行较为普遍，不仅影响牦牛健康，还制约牦牛养殖业的发展[2]。大肠杆菌在牦牛体内属于常在菌，可通过致病性大肠杆菌感染导致牦牛腹泻，严重时还会发生死亡，目前主要依靠抗生素进行大肠杆菌病的预防和治疗，易产生耐药性[3]。大肠杆菌病的耐药性问题已日趋严重，也从未停止过对其耐药性的监测[4-7]。大量试验证实大肠杆菌可经接合、转座等方式进行水平传播[8]，临床可通过检测耐药基因的存在情况，对耐药流行情况进行实时监测。本试验以拉萨市林周县牦牛腹泻粪便为靶标，通过常规的细菌学实验技术进行腹泻病原菌的分离鉴定，然后使用国际公认的K-B纸片法对常用抗生素的药物敏感性情况进行监测[9]。

1 试验材料

1.1 样品来源

本试验的40份牦牛腹泻粪便均采集于拉萨市林周县某牛场。

1.2 质控菌株来源

质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要试剂

氯霉素、青霉素、多粘菌素B等15种抗菌药物均购自杭州微生物试剂有限公司，普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基均购自杭州微生物试剂有限公司，沙门菌分离鉴定所用培养基干粉均购自美国BD公司，PCR试剂、核酸染料4S Red plus等购自上海生物工程有限公司。

1.4 主要仪器

高速离心机centrifuge 5804，由德国Eppendorf公司生产；PCR扩增设备，由美国Bio-Rad公司生产；移液器，由德国Eppendorf公司生产；核酸蛋白测定仪，由Thermo公司生产。

2 试验方法

2.1 生化试验

取纯培养物进行常规生化试验，并按照说明书判定反应结果。

2.2 药敏试验

药敏试验按照CLSI推荐的K-B法进行。抑菌结果可依据表1所列标准进行判定[10，11]。

2.3 引物设计

从GenBank中检索已登录的信息，用DNA Star软件找出保守序列，然后采用Primer 5设计16S rRNA序列P基因引物（F:5′-ATGGCTCAGA TTGAACGC-3′；R：5′-CAGGTTCCCCTAC GGTTA-3′，Product：1 500 bp），沙门菌肠毒素Stn基因引物（F:5′-CTTTGGTCGTAAAATA AGGCG-3′；R：5′-TGCCCAAAGCAGAGA GATTC-3′，Product：260 bp）[12,13]，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。