牦牛卵泡发育及卵母细胞成熟过程中CYP19A1表达差异分析

孙 莹，王 萌，孙晓军，王靖雷，马 睿，余四九，潘阳阳*

（1.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.兰州市动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730050）

牦牛（Bos grunniens）主要分布在海拔3 000～5 000 m的青藏高原地区，该地空气稀薄、草料短缺。目前，牦牛为人类提供牦牛肉、牦牛奶、皮革制品，也可作为交通工具、使役工具，抗逆性极强，是牧民重要的生活来源、经济来源[1-3]。牦牛虽属于季节性多次发情的动物，但与生活在平原的其他家畜相比，70%的雌性个体在发情季节只发情一次，一头成年牦牛平均繁殖率约48.61%，又因地处恶劣多变的高原环境，发情时间、生产性能极易受到季节性变化及牧草质量的影响[4,5]。目前，对牦牛卵巢的研究多集中于解剖学范畴，而在分子机制上尚不完善[6]。因此，本研究以牦牛为模型，探究CYP19A1在不同发育时期卵泡及卵母细胞上的表达以及对牦牛生殖生理的调控。

卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官，具有促进卵泡生长、排卵、黄体形成及溶解的功能，对哺乳动物的繁殖力起决定性作用[7,8]。卵泡在卵巢中成熟的过程是受多种激素、细胞因子调节的复杂生物过程，其中以甾体激素为主要调节机制。CYP19A1是细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）家族的成员之一，在卵巢、胎盘、垂体等组织中均有不同程度的表达。由CYP19A1编码的细胞色素P450芳香化酶是该通路的关键限速酶，卵泡膜细胞雄激素是E2的前体，它通过卵巢颗粒细胞的E2合成通路合成E2，即在粒细胞中催化雄激素转变为雌激素[9]。其中，E2是雌激素中活性最高、妊娠期间母体最主要的雌激素。在分子水平上，E2促进卵巢颗粒细胞的增殖，抑制其凋亡和卵泡闭锁。研究表明，抑制CYP19A1的表达会导致E2分泌不足，卵泡闭锁，无黄体生成[10,11]。因此，本研究检测CYP19A1在牦牛不同级别卵泡及卵母细胞成熟过程中的表达水平及位置分布，旨在进一步研究CYP19A1在牦牛雌性生殖中的作用机制，为探索牦牛特殊的生殖生理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phos-phate buffered saline，D-PBS）购自Sigma公司（美国）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自PAN公司（澳大利亚）；TransZol RNA提取试剂盒（TransGen，北京）；Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ（艾科瑞生物，湖南）；SYBR GreenⅡ荧光定量PCR试剂盒（宝生物，大连）；CYP19A1 Antibody（亲科生物，常州）、免疫荧光检测试剂购于南京碧云天生物公司。

1.2 样品采集与体外培养

2020年8—12月于青海省西宁市马佳肴屠宰场采集牦牛卵巢，置于装有35℃含抗生素（青链霉素）的生理盐水中，4 h内带回实验室。37℃生理盐水（含青链霉素）清洗3遍，用带有18G针头的注射器（防止针头过细刮伤卵母细胞）抽取卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液，将提前在37℃恒温箱内平衡后的采卵液（D-PBS＋5%FBS）与卵泡液在离心管中混匀；将混合后的采卵液倒入50 mm培养皿中，置于体视显微镜下，用捡卵针挑选并移入装有37℃采卵液的培养皿中，用无血清PBS清洗3次；然后转入卵母细胞成熟培养液中，在37℃、5%CO2和饱和湿度培养箱中进行培养。分别收集未成熟卵母细胞（0 h）、成熟12 h卵母细胞、成熟18 h卵母细胞和成熟卵母细胞（24 h）各40枚，将不同阶段卵母细胞分为两份，一份用于提取RNA，-80℃保存，另一份置于固定液用于后续免疫荧光染色。

1.3 牦牛COCs及卵泡液总RNA的提取与反转录

对于编码基因的定量，首先需参照TransZol RNA提取试剂盒和Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ说明书，分别提取不同成熟阶段COCs的RNA（0 h、12 h、18 h和24 h）和卵泡大小为0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm及大于8 mm时卵泡液的RNA，反转录合成相应cDNA，存于-20℃，用于后续qRT-PCR检测。

1.4 设计引物

根据Genbank上所公布的牛的CYP19A1、β-Actin基因的基因序列，使用Primer 5软件设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成所需引物，其详细信息及反应条件见表1，利用普通PCR对引物进行初步验证。

表1 CYP19A1引物信息

1.5 qRT-PCR技术检测CYP19A1基因的相对表达量

使用LightCycler® 96 SW 1.1（Roch，Switzerland）实时荧光定量PCR仪，总体系20 μl，反应体系为模板cDNA 1 μl（500 ng/μl），上、下游引物各0.5 μl（0.2 μmol/ml），2*SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μl，ddH2O 8 μl。反应条件为95℃预变性10 s；95℃变性10 s、退火10 s（具体温度见表1）、72℃延伸10 s，重复共40个循环，建立4个重复，设置β-Actin为内参基因，根据熔解曲线确定反应特异性，利用所得每个样品的循环阈值（Ct值），采用2-ΔΔCt法计算CYP19A1的相对表达量。

1.6 免疫荧光染色检测COCs中CYP19A1蛋白的表达

通过免疫荧光染色技术对卵丘—卵母细胞复合体的CYP19A1蛋白进行定位检测，首先对在4℃用交联剂（4%多聚甲醛）固定后的细胞进行通透处理，以保证后续抗体能够顺利进入相应抗原位点，其次使用免疫封闭液孵育1 h，使非特异性结合蛋白位点封闭，再用CYP19A1抗体4℃孵育过夜，清洗3遍后用二抗孵育结合，再清洗3遍用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，最后清洗3遍封片镜验，用奥林巴斯荧光倒置显微镜观察并拍照。

1.7 数据分析

对所得结果进行单因素方差分析（oneway，ANOVA），每组至少重复3遍以上，所有数据用平均值±标准误（mean±SE）表示，通过Graphpad prism 7绘制柱状图（P<0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 CYP19A1引物特异性检测

2.1.1 核酸电泳检测引物特异性 对卵泡液、COCs的RNA反转录所得的cDNA进行普通PCR扩增，CYP19A1、β-Actin PCR产物大小分别为184 bp、143 bp，核酸电泳结果如图1所示，可见片段大小与预期一致，条带成像清晰，无非特异性结合片段。由此可见，所设计的引物特异性良好、模板质量高。需特别注意CYP19A1基因在卵泡大小为3～5 mm及大于8 mm的卵泡液中不表达，具体结果可结合后续实时荧光定量PCR进行分析。

图1 CYP19A1在卵泡液和卵母细胞中表达的核酸电泳结果

2.1.2 qRT-PCR技术检测CYP19A1扩增所得熔解曲线的结果 通过qRT-PCR技术检测CYP19A1的扩增情况，验证其引物特异性，结果如图2所示。熔解曲线是单峰，且出峰位置即退火温度，再次证明该引物特异性良好。

图2 qRT-PCR检测CYP19A1扩增所得熔解曲线的结果

2.2 qRT-PCR技术检测CYP19A1在不同阶段卵泡液和COCs中的表达结果

qRT-PCR结果如图3所示，CYP19A1在卵泡液发育的各个时期均表达，相对表达量随卵泡增大呈逐渐下降趋势。在卵泡大小为0～3 mm时，CYP19A1的相对表达量最高，卵泡大小大于5 mm的卵泡液中CYP19A1表达量已呈现较低水平。同样在COCs成熟的各个阶段均表达，在未成熟的COCs中，CYP19A1的相对表达量最低，成熟18 h的COCs中相对表达量达到最高值，之后呈下降趋势。

2.3 免疫荧光染色检测CYP19A1蛋白在COCs上的表达定位

对不同发育时期的COCs进行免疫荧光染色处理后，结果如图4所示，CYP19A1在不同时期COCs的卵丘细胞、卵母细胞中均有表达，并且目的蛋白表达位置与骨架蛋白β-Tubulin表达位置一致。同时，由图4可见在成熟18 h的COCs卵丘细胞中CYP19A1蛋白的荧光信号更明显，对比DAPI细胞核标记，CYP19A1主要在卵丘细胞的细胞质中表达。

3 讨论

由垂体释放的催乳素（Prolactin，PRL）、促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH）、促黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）共同作用，能显著促进促性腺激素释放激素（Gonadotrophin releasing hormone，GnRH）诱导的睾酮（Testosterone，T）和雌二醇的释放[12,13]。诱导卵巢颗粒细胞释放类固醇激素，调控卵泡和颗粒细胞的生长发育以及相关基因（FSHR、LHR、CYP11、CYP19）的表达，其中基因CYP19A1的表达活化芳香化酶，催化雄激素芳香化，将睾酮转化为雌二醇，诱导卵泡正常发育、优势卵泡的选择、维持卵巢正常的组织结构[14-16]。由此可见，卵泡和颗粒细胞的生长发育均依赖于E2的分泌，CYP19A1在其中起关键的调控作用，是母畜提高繁殖力的重要保障[17]。另有研究表明，敲除小鼠CYP19A1基因，E2分泌量下降，卵泡由此发生闭锁，卵巢无黄体产生，雌性动物性状发育偏雄性化，甚至引起小鼠不孕[18-20]。由此可见，CYP19A1对雌性哺乳动物的发育繁殖产生积极影响，特别是对卵泡的扩张、卵母细胞的成熟发挥关键作用。因此，本研究以牦牛不同发育时期的卵泡和不同成熟阶段的卵丘—卵母细胞复合体为模型，对提高牦牛生产性能具有重要的实践意义。

通过利用qRT-PCR技术对不同发育时期的卵泡及卵母细胞中CYP19A1基因的相对表达量进行检测，结果显示CYP19A1基因在卵泡大小为0～3 mm时的表达量最高，随着卵泡大小的扩增、卵泡的成熟，表达量逐渐降低，而在COCs发育早期表达量相对较低，COCs成熟18 h时表达量最高。由此可见，CYP19A1在卵泡发育早期主要集中于卵母细胞，在卵子形成过程中发挥重要作用，促使卵泡扩张，而在卵泡细胞发育后期，CYP19A1的表达则集中于卵丘细胞上，通过诱导颗粒细胞释放E2，加速卵丘细胞与卵母细胞的营养交换、物质代谢，以卵母细胞为靶细胞表达，促进卵母细胞成熟。根据免疫荧光染色结果与上述结果对应，CYP19A1在COCs的卵丘细胞中荧光强度更高，推测CYP19A1在COCs中主要在卵丘细胞中表达，诱导激素分泌，作用于卵母细胞，增强卵丘细胞与卵母细胞间的物质代谢，促进卵母细胞的成熟。

4 结论

本试验在牦牛不同级别卵泡发育及卵母细胞成熟的过程中对CYP19A1的表达进行定位分析，研究发现CYP19A1基因在牦牛不同级别的卵泡及卵母细胞中均有表达，其中分别在卵泡发育早期（0～3 mm）、成熟18 h的COCs中表达量最高，免疫荧光染色结果显示CYP19A1在COCs中的表达主要集中在卵丘细胞，推测CYP19A1参与并促进卵泡的发生和卵母细胞的形成，揭示了CYP19A1在雌性牦牛的生殖过程中对卵泡发育和卵母细胞的成熟均起到积极的调控作用，为进一步探索牦牛生殖生理中的分子机制奠定了基础。