miR-577通过靶向调控HOXA1对乳腺癌MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移的影响

丁保锋

【摘要】 目的：探討miR-577靶向调控HOXA1对乳腺癌MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：将体外培养的MDB-MA-231细胞分为对照组（未处理）、miR-NC组（转染miR-577模拟物阴性对照）、miR-577组（转染miR-577模拟物）、miR-577+pcDNA组（转染miR-577模拟物和pcDNA3.1质粒）和miR-577+HOXA1组（转染miR-577模拟物和pcDNA3.1-HOXA1质粒），采用实时荧光定量PCR测定MDB-MA-231细胞中miR-577和HOXA1 mRNA的表达，Western blot测定HOXA1蛋白表达，荧光素酶报告基因实验测定miR-577和HOXA1的靶向关系，CCK-8法测定MDB-MA-231细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期分布，Transwell小室测定MDB-MA-231细胞侵袭和迁移。结果：与对照组、miR-NC组相比，miR-577组细胞中miR-577表达水平、G0/G1期细胞百分比升高，HOXA1 mRNA和蛋白表达水平、48与72 h细胞增殖活力、S期细胞百分比、侵袭细胞数和迁移细胞数均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与miR-577组、miR-577+pcDNA组相比，miR-577+HOXA1组中HOXA1 mRNA和蛋白表达水平、48与72 h细胞增殖活力、S期细胞百分比、侵袭细胞数和迁移细胞数均升高，G0/G1期百分比降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-577可通过靶向HOXA1抑制MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移。

【关键词】 miR-577 乳腺癌 HOXA1 增殖 侵袭 迁移

Effects of miR-577 Inhibits Proliferation， Migration and Invasion of Breast Cancer MDB-MA-231 Cells by Targeting HOXA1/DING Baofeng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（10）： 0-018

[Abstract] Objective： To investigate the effects of miR-577 targeting HOXA1 on proliferation， invasion and migration of breast cancer MDB-MA-231 cells. Method： MDB-MA-231 cells cultured in vitro were divided into control group （untreated）， miR-NC group （transfected negative control of miR-577 mimics）， miR-577 group （transfected miR-577mimics）， miR-577+pcDNA group （transfected miR-577 mimics and pcDNA 3.1 plasmids） and miR-577+HOXA1 group （transfected miR-577 mimics and pcDNA3.1-HOXA1 plasmids）. The expression of miR-577 and HOXA1 mRNA in MDB-MA-231 cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR， the expression of HOXA1 protein was measured by Western blot， the targeting relationship between miR-577 and HOXA1 was checked by double luciferase reporter gene assay， the proliferation of MDB-MA-231 cells was tested by CCK-8， the cell cycle was examed by flow cytometry， the migration and invasion of MDB-MA-231 cells were detected by Transwell chamber. Result： Compared with the control group and the miR-NC group， the expression level of miR-577 and the percentage of G0/G1 phase cells in the miR-577 group were increased， the expression levels of HOXA1 mRNA and protein， the proliferation activity of cells at 48 and 72 h， the percentage of cells in the S phase， the number of invaded cells and the number of migrated cells were decreased， the differences were statistical significance （P<0.05）. Compared with the miR-577 group and the miR-577+pcDNA group， HOXA1 mRNA and protein expression levels， proliferation activity of cells at 48 and 72 h， percentage of cells in S phase， number of invading cells and number of migrating cells in the miR-577+HOXA1 group were all increased， while percentage of cells in G0/G1 phase was decreased， the differences were statistical significance （P<0.05）. Conclusion： miR-577 can inhibit proliferation， invasion and migration of MDB-MA-231 cells by targeting HOXA1.

[Key words] miR-577 Breast cancer HOXA1 Proliferation Invasion Migration

First-authors address： The Central Hospital of Jiamusi City， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.10.004

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类广泛分布于机体血液、组织和唾液中的内源性非编码RNA，常被作为肿瘤早期诊断和预后不良的重要指标，也是肿瘤基因治疗的潜在靶分子，其可通过碱基互补配对抑制翻译或降解靶mRNA参与包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发生发展[1]。miR-577是miRNAs中的重要成员，被证实在肝癌、结肠癌和胶质母细胞瘤等肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程中发挥着重要的抑制作用[2-3]。Yin等[4]证实miR-577在乳腺癌组织中低表达，与肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴转移等有关，可通过靶向Rab25抑制癌细胞上皮间质转化和转移;但miR-577在乳腺癌中的作用及机制并不完全清晰。同源盒A1（HOXA1）是同源盒（HOX）基因家族成员，被证实在乳腺癌中异常高表达，通过调控癌细胞增殖、侵袭和迁移等促进肿瘤进展[5]。有研究指出，miR-577可通过靶向调控HOXA1表示抑制肝癌细胞侵袭和迁移，但其是否可能通过靶向调控HOXA1影响乳腺癌的发生发展尚不清楚[6]。因此，本研究以乳腺癌MDB-MA-231细胞为研究对象，通过观察miR-577与HOXA1的靶向关系，探讨miR-577通过靶向调控HOXA1对MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移等影响，以期为miR-577用于乳腺癌的治疗靶点提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人乳腺癌MDB-MA-231细胞株购于美国ATCC，BCA蛋白浓度试剂盒购于上海碧云天公司，CCK-8试剂盒购于上海威奥生物公司，碘化丙啶购于北京索莱宝公司，Lipo2000购于美国Invitrogen公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，兔抗人HOXA1单克隆抗体购于美国Sigma公司，鼠抗人GAPDH单克隆抗体和羊抗鼠/兔IgG二抗购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。ECL底物液购于美国Thermo公司，Transwell购于美国BD Biosciences公司，反转录和qPCR试剂盒购于大连宝生物公司，Dual luciferase assays试剂盒购于美国Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。pcDNA3.1-HOXA1过表达载体质粒由上海北诺生物公司设计完成。miR-577模拟物及其阴性对照购于广州锐博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MDB-MA-231细胞培养与转染 实验分组：对照组（未处理）、miR-NC组（转染miR-577模拟物阴性对照）、miR-577组（转染miR-577模拟物），miR-577+pcDNA组（转染miR-577模拟物和pcDNA3.1质粒）和miR-577+HOXA1组（转染miR-577模拟物和pcDNA3.1-HOXA1质粒）。

1.2.2 实时荧光定量PCR测定miR-577和HOXA1 mRNA的表达 取转染后的MDB-MA-231细胞于EP管中，应用Trizol试剂提取细胞总RNA。将定量后的RNA作为模板，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。取稀释10倍的cDNA 4 μL作為模板，并与100 μm的上下游引物各0.4 μL、SYBR Green qPCR Master Mix（2×）10 μL和ddH2O 5.2 μL混匀配成20 μL的PCR反应体系;并按照94 ℃、6 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，

共40个循环的反应条件行溶解曲线。程序完成后，以U6和GAPDH为内参，2-△△Ct法进行数据分析。miR-577引物序列（F：5-ACCGCGCGCGCGTAGATAAAATATTGG-3，R：5-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3），U6引物序列（F：5-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3，R：5-AAATATGGAACGCTTCACGA-3），HOXA1引物序列（F：5-TCCTGGAATACCCCATACTTAGCA-3，R：5-GCCGCCGCAACTGTTG-3）和GAPDH引物序列（F：5-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3，R：5-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3）。

1.2.3 Western blot测定HOXA1蛋白的表达 将收集到的MDB-MA-231细胞以磷酸缓冲液洗涤后，加入预冷的细胞裂解液抽取总蛋白。根据BCA蛋白检测试剂盒说明书对总蛋白的浓度进行定量。取50 μg蛋白样品行12%SDS-PAGE电泳（120 V，

2 h）分离后，转PVDF膜（250 mA，1.5 h）。转入含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭液中室温作用1 h。将膜转入封闭液稀释工作浓度分别为1︰500和

1︰1 000的HOXA1抗体和GAPDH抗体，4 ℃下孵育过夜。再转入封闭液稀释1︰5 000的二抗常温孵育2 h。将ECL工作液滴加到PVDF膜上，置于暗室内显影、曝光。采用凝胶成像系统扫描分析HOXA1蛋白的表达水平。

1.2.4 CCK-8法测定MDB-MA-231细胞增殖情

况 采用胰蛋白酶消化收集转染48 h后的各组MDB-MA-231细胞，以每孔10 000个细胞密度接种至96孔细胞板上，每组设置5个平行孔。放入培养箱内分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂反应4 h后，上机于450 nm波长处检测各组细胞的光密度值。重复检测3次。

1.2.5 流式细胞仪测定MDB-MA-231细胞的周期变化 以磷酸缓冲液（预冷）洗涤收集到的各组MDB-MA-231细胞后，预冷的70%乙醇固定细胞12 h。经磷酸缓冲液洗涤后，以碘化丙啶对细胞染色30 min，上机于488 nm处检测各组MDB-MA-231细胞的周期变化。

1.2.6 Transwell小室测定MDB-MA-231细胞侵袭迁移情况 将转染48 h后的各组MDB-MA-231细胞制成浓度为3 000个/mL的细胞悬液。取200 μL细胞液加入以基质胶包被或不包被的Transwell小室上室中，另取含胎牛血清的培养液600 μL加入到小室下室中。放入培养箱中培养过夜。将小室取出，小心擦去上室内残留的细胞，经4%多聚甲醛固定和0.5%结晶紫后，显微镜下随机选取5个视野统计下室面的细胞数量，结果取均值。

1.2.7 荧光素酶报告基因实验测定miR-577与HOXA1的关系 应用TargetScanHuman软件预测到miR-577与HOXA1的3-UTR存在互补的核苷酸序列。构建突变型HOXA1-MUT和野生型HOXA1-WT的HOXA1 3-UTR荧光素酶报告载体，参照Lipo 2 000说明书行miR-577+HOXA1-MUT（共转染miR-577模拟物和HOXA1-MUT）、miR-577+HOXA1-WT（共转染miR-577模拟物和HOXA1-WT）、miR-NC+HOXA1-MUT（共转染miR-577模拟物阴性对照和HOXA1-MUT）和miR-NC+HOXA1-WT（共转染miR-577模拟物阴性对照和HOXA1-WT）四组共转染，培养箱内常规培养48 h后，根据Dual luciferase assays试剂盒说明书测定各组细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0軟件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，组间多重比较采用SNK-q，多组间比较使用单因素方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后MDB-MA-231细胞中miR-577和HOXA1的表达结果 与对照组、miR-NC组相比，miR-577组细胞中miR-577的表达水平均显著升高，而HOXA1 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）;与miR-577组、miR-577+pcDNA组比较，miR-577+HOXA1组细胞中miR-577水平差异均无统计学意义（P>0.05），而HOXA1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05）;而miR-NC组与对照组比较，miR-577组与miR-577+pcDNA组比较，miR-577表达、HOXA1 mRNA和蛋白表达水平的差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1、表1。

2.2 miR-577与HOXA1的靶向关系 经TargetScanHuman软件预测发现，miR-577与HOXA1 3 UTR存在互补核苷酸序列，见表2。

miR-NC+HOXA1-WT组荧光素酶活性值为（0.98±0.06），miR-577+HOXA1-WT组荧光素酶活性值为（0.39±0.03），miR-NC+HOXA1-MUT组荧光素酶活性值为（0.96±0.06），miR-577+HOXA1-MUT组荧光素酶活性值为（0.94±0.05）。与miR-NC+HOXA1-WT组相比，miR-577+HOXA1-WT组细胞的荧光素酶活性显著降低（P<0.05）;而miR-NC+HOXA1-MUT组与miR-577+HOXA1-MUT组细胞荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）;四组间比较差异有统计学意义（F=92.255，P=0.000）。

2.3 miR-577靶向调控HOXA1对MDB-MA-231细胞增殖的影响 miR-577组与对照组、miR-NC组相比，miR-577+HOXA1组与miR-577组、miR-577+pcDNA组相比，细胞在24 h作用时间下增殖活力差异均无统计学意义（P>0.05）。在48、72 h

作用时间下，miR-577组的细胞增殖活力较对照组、miR-NC组均明显减弱（P<0.05），miR-577+HOXA1组较miR-577组、miR-577+pcDNA组均显著增强（P<0.05）;而miR-NC组与对照组相比，miR-577+pcDNA组与miR-577组相比，细胞增殖活力差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 miR-577靶向调控HOXA1对MDB-MA-231细胞周期的影响 miR-577组、miR-577+pcDNA组和miR-577+HOXA1组中G0/G1期细胞百分比均显著高于对照组、miR-NC组，S期细胞百分比均显著低于对照组、miR-NC组（P<0.05），G2/M期细胞百分比与对照组、miR-NC组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;miR-577+HOXA1组中G0/G1期细胞百分比较miR-577组、miR-577+pcDNA组显著降低，S期细胞百分比较miR-577组、miR-577+pcDNA组显著升高（P<0.05），G2/M期细胞百分比与miR-577组、miR-577+pcDNA组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;而对照组与miR-NC组、miR-577+pcDNA组与miR-577组G0/G1期、S期及G2/M期细胞百分比比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.5 miR-577靶向调控HOXA1对MDB-MA-231细胞侵袭和迁移的影响 与对照组、miR-NC组相比，而miR-577组侵袭细胞数和迁移细胞数中均显著减少（P<0.05）;与miR-577组、miR-577+pcDNA组相比，miR-577+HOXA1组中侵袭细胞数和迁移细胞数显著增多（P<0.05）;而对照组与miR-NC组相比，miR-577组与miR-577+pcDNA组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表5。

3 讨论

乳腺癌是一种起源于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，多见于女性;近年来其发病率有升高和年轻化的趋势，严重威胁着女性身体健康[7-9]。深入探讨乳腺癌的发生发展机制，寻找新的有效的治疗靶点对治疗乳腺癌具有重要意义。近年来，miR-577在肿瘤发生发展中的作用逐渐引起关注。在胃癌的研究中，何银平等[10]证实，miR-577表达下调，且与肿瘤TNM分期、淋巴结转移等有关，上调其表达可通过下调β-catenin抑制癌细胞侵袭;Yu等[11]指出，miR-577过表达可通过靶向调控E2F3诱导癌细胞阻滞于G1期抑制胃癌细胞增殖。Wang等[12]在非小细胞肺癌的研究发现，miR-577表达下调，上调其表达可通过调节Wnt2b介导的Wnt/β-catenin途径抑制细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间充质转化。在甲状腺乳头状癌研究中，miR-577表达下降，其过表达可通过靶向调控Sphk2抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移[13]。另外，miR-577在肿瘤发生发展中的抑癌作用在肝癌、结肠癌和胶质瘤等中也得以证实[14-16]。本研究结果显示，miR-577过表达可抑制乳腺癌MDB-MA-231增殖、侵袭、迁移并诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，这提示，miR-577在乳腺癌发生发展过程中也发挥着与上述文献相似的抑癌作用。

HOX基因家族是一类与肿瘤发生发展关系密切的转录调节因子，通过结合DNA调控相关基因表达，在细胞增殖、侵袭和迁移等过程中发挥着重要作用[17-18]。HOXA1是HOX基因家族成员，其异常表达也往往影响着肿瘤的恶性进展。研究显示，HOXA1在胃癌组织中的蛋白阳性表达率明显升高，且其高表达的患者3年生存率明显低于低表达患者，其促进胃癌发展进程[19];AFAP1-AS1在口腔鳞状细胞癌中表达升高，敲低其表达可通过竞争性吸附miR-145进而抑制HOXA1的表达降低口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，AFAP1-AS1/miR-145/HOXA1轴为口腔鳞状细胞癌的治疗提供了潜在分子靶点[20];miR-100可通过靶向抑制HOXA1阻碍非细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，miR-100/HOXA1轴在非细胞肺癌细胞中发挥抑癌基因作用[21];HOXA1在乳腺癌中异常高表达，在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程中发挥着重要的促进作用，敲低其表达可抑制乳腺癌的恶性进展[22]。猜测miR-577可能通过靶向HOXA1调控细胞增殖、侵袭和迁移进而影响乳腺癌的进展。为了探讨miR-577抑制乳腺癌进展的分子机制，本研究通过生物信息学软件预测到miR-577与HOXA1 3 UTR存在互补核苷酸序列，荧光素酶报告基因实验证实，HOXA1是miR-577的一个潜在靶基因。同时，过表达HOXA1后miR-577对MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移的作用均明显得到部分逆转。这提示，miR-577可通过靶向调控HOXA1抑制MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移。

综上所述，HOXA1是miR-577的潜在靶基因，miR-577可通过靶向HOXA1抑制乳腺癌MDB-MA-231细胞增殖、迁移和侵袭。该结果可能为miR-577有望成为乳腺癌治疗的候选基因提供重要的参考依据。

参考文獻

[1] Goh J N，Loo S Y，Datta A，et al.microRNAs in breast cancer： regulatory roles governing the hallmarks of cancer[J].Biological Reviews，2016，91（2）：409-428.

[2] 张庆玲.miR-205在乳腺癌患者血浆中的表达及临床意义研究[J].中国医学创新，2018，15（33）：5-8.

[3] Zhang W，Shen C，Li C，et al.miR-577 inhibits glioblastoma tumor growth via the Wnt signaling pathway[J].Molecular Carcinogenesis，2016，55（5）：575-585.

[4] Yin C，Mou Q，Pan X，et al.MiR-577 suppresses epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer by targeting Rab25[J].Thoracic Cancer，2018，9（4）：472-479.

[5] Wang X，Li Y，Qi W，et al.MicroRNA-99a inhibits tumor aggressive phenotypes through regulating HOXA1 in breast cancer cells[J].Oncotarget，2015，6（32）：32737-32747.

[6] Han S，Liu Z，Wang Y，et al.MicroRNA577 inhibits the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting homeobox A1[J].Oncology Reports，2018，39（6）：2987-2995.

[7]朱海燕，许凤波.健康教育的模式对乳腺癌术后功能锻炼及生活质量的影响[J].中国药物与临床，2019，19（12）：2101-2103.

[8]徐敏，马宜传.乳腺癌的MRI诊断价值及应用进展[J].淮海医药，2018，36（2）：249-252.

[9] Rappaport J.Changes in Dietary Iodine Explains Increasing Incidence of Breast Cancer with Distant Involvement in Young Women.[J].Journal of Cancer，2017，8（2）：174.

[10]何银平，叶景旺.miR-577在胃癌中的表达及对SGC-7901细胞侵袭的影响[J].医学研究杂志，2016，45（10）：95-98.

[11] Yu Z，Zhang W，Deng F.MicroRNA-577 inhibits gastric cancer growth by targeting E2F transcription factor 3[J].Oncology Letters，2015，10（3）：1447-1452.

[12] Wang B，Sun L，Li J，et al.miR-577 suppresses cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition by regulating the WNT2B mediated Wnt/β-catenin pathway in non-small cell lung cancer[J].Molecular Medicine Reports，2018，18（3）：2753-2761.

[13] Xue K C，Hu D D，Zhao L，et al.MiR-577 inhibits papillary thyroid carcinoma cell proliferation， migration and invasion by targeting SphK2[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（17）：3794-3800.

[14] Wang L Y，Li B，Jiang H H，et al.Inhibition effect of miR-577 on hepatocellular carcinoma cell growth via targeting β-catenin[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2015，8（11）：923-929.

[15] Wang Y，Lu Z，Wang N，et al.Long noncoding RNA DANCR promotes colorectal cancer proliferation and metastasis via miR-577 sponging[J].Experimental & Molecular Medicine，2018，50（5）：1-7.

[16]Wei N，Wei H，Zhang H.Long non-coding RNA ZEB1-AS1 promotes glioma cell proliferation， migration and invasion through regulating miR-577[J].European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2018，22（10）：3085-3093.

[17]王斌，張逊.同源盒基因与肿瘤的研究进展[J].医学综述，2017，23（7）：1329-1333.

[18]罗宝洋，蔡辉华，安勇，等.长链非编码RNA-HOX转录反义RNA与微小RNA的相互调控在肿瘤中的研究进展[J].中华实验外科杂志，2018，35（3）：585-588.

[19]林玲，李政文，韩峰，等.胃癌组织miR-30b和HOXA1的表达及与临床病理特征的关系[J].河北医药，2019，41（13）：88-92.

[20] Han W Z，Ren X X，Yang Y P，et al.microRNA-100 functions as a tumor suppressor in non-small cell lung cancer via regulating epithelial-mesenchymal transition and Wnt/β-catenin by targeting HOXA1[J].Thorac Cancer， 2020， 11（6）：1679-1688.

[21] Li M H，Yu D S，Li Z H，et al.Long non-coding RNA AFAP1-AS1 facilitates the growth and invasiveness of oral squamous cell carcinoma by regulating the miR-145/HOXA1 axis[J].Oncology Reports，2021，45（3）：1094-1104.

[22]叶柳青，丁金旺，张敏，等.同源盒基因转录反义RNA （HOTAIR）在乳腺癌临床诊疗中的研究进展[J].中华全科医学，2018，16（2）：286-290.

（收稿日期：2020-07-13） （本文编辑：刘蓉艳）