Tiam1基因和蛋白在子宫颈癌组织中的表达及与预后的关系

李翠，钱慧珍，杨美娇，李聪，张君

（中国医科大学附属盛京医院大连医院病理科，辽宁 大连330000）

T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1（Tiam1）是一种在正常人脑组织和睾丸中具有高表达的基因，但对于恶性肿瘤患者，Tiam1可参与肿瘤细胞迁移、侵袭、浸润的过程，在癌细胞扩散中发挥重要的作用[1]。子宫颈癌是一种发病率及病死率较高的常见妇科恶性肿瘤，且其发病趋于年轻化，已成为临床研究的重点[2]。但临床关于Tiam1基因和蛋白与子宫颈癌的研究较少，对其在子宫颈癌中的作用机制尚不明确。鉴于此，本研究旨在探讨Tiam1基因和蛋白在子宫颈癌组织中的表达及与预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年6月至2019年9月于本院行子宫颈组织手术切除的158例患者，根据留取组织不同分为正常宫颈组织组（n=46）、宫颈上皮瘤变组（n=52）、子宫颈癌组（n=60）。正常宫颈组织组年龄31～64岁，平均年龄（40.31±7.42）岁。宫颈上皮瘤变组年龄30～60岁，平均年龄（39.64±7.17）岁；分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级24例，Ⅲ级10例。子宫颈癌组年龄34～69岁，平均年龄（41.23±7.89）岁；分型：鳞癌41例，腺癌19例。3组患者临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。所有患者均对本研究知情同意，并自愿签署知情同意书。本研究已通过医院伦理委员会审核批准。

1.2 设备及试剂 实时荧光定量PCR仪（美国ABI）、光学显微镜（日本Olympus）、总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）、逆转录和PCR试剂盒（日本Takara）、Tiam1和内参引物（上海生工公司）、SP免疫组织化学试剂盒和DAB试剂及PBS（北京中杉金桥公司）、兔抗人Tiam1多克隆抗体（美国Santa Cruz）。

1.3 方法3组患者均采集2份标本，一份置于-80℃保存，一份制备成石蜡切片。①Tiam1 mRNA表达：取各组标本组织研磨，加入细胞裂解液，采用总RNA提取试剂盒提取各组的总RNA，并用紫外分光光度计检测其纯度，合格标准为A260/A280≥1.8。将总RNA逆转录为模板单链cDNA并用PCR试剂盒扩增，引物序列依次为Tiam1引物、β-actin引物，同时，PCR反应条件依次为：94℃预变性30 s；92℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环36次。对每份组织设置3个平行反应孔，获取其中Tiam1基因的相对表达量。②Tiam1蛋白表达：将各组的石蜡标本切片、脱蜡和水化，置于浓度为3%的过氧化氢-甲醇在37℃下孵育30 min，并用PBS洗涤3次，置入柠檬酸缓冲液中煮沸10 min，冷却后，再用PBS冲洗3次。常温下滴入10%浓度的山羊血清，密闭存储20 min，滴入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗体（1:500），置入4℃冰箱中孵育过夜，取出后用PBS冲洗3次，以同型的IgG作为对照，加入增强剂，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入HRP标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入DAB显色并用苏木素复染，中性树脂封片，用光学显微镜观察。由2位高经验的病理科医师独立评判，若细胞质内出现黄色、棕黄色或黄褐色染色即为阳性，并对其评分。颜色评分：0分（不染色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕褐色）；阳性细胞比例评分：0分（≤5%）、1分（6%～25%）、2分（26%～75%）、3分（＞75%）；总评分=颜色评分×阳性细胞比例评分。依据总评分将Tiam1蛋白表达换分为：阴性（0分）、弱阳性（1～3分）、中等阳性（4～6分）、强阳性（7～9分）。

1.4 观察指标 检测3组中Tiam1 mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率，并分析与预后的关系。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tiam1基因表达 正常宫颈组织组、宫颈上皮瘤变组、子宫颈癌组Tiam1 mRNA相对表达量分别为（1.26±0.17）、（1.76±0.23）、（2.06±0.18），子宫颈癌组Tiam1 mRNA水平明显高于正常宫颈组织组和宫颈上皮瘤变组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Tiam1蛋白表达 子宫颈癌组Tiam1蛋白阳性率高于正常宫颈组织组和宫颈上皮瘤变组，且宫颈上皮瘤变组阳性率高于正常宫颈组织组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 3组Tiam1蛋白阳性率比较[n（%）]

2.3 子宫颈癌组织中Tiam1表达与预后关系 以P25为Tiam mRNA为临界值将子宫颈癌组分为高表达组（n=39）和低表达组（n=21），高表达组复发率为76.92%（30/39），明显高于低表达组的42.86%（9/21），差异有统计学意义（χ2=6.963，P=0.008）；子宫颈癌组Tiam1蛋白阴性表达患者复发率为18.18%（2/11），明显低于阳性表达患者的71.43%（35/49），差异有统计学意义（χ2=8.640，P=0.001）。

3 讨论

子宫颈癌细胞具有极强的转移能力，因此，在行手术切除后仍有较高的复发率，而有学者认为Tiam1与癌细胞转移与子宫颈癌复发密切相关，因此，从分子水平探讨Tiam1在子宫颈癌组织内的表达，分析其对癌细胞迁移、侵袭的相关机制，有助于及早提高基因治疗靶位，改善患者预后[3-4]。

本研究结果显示，子宫颈癌组Tiam1 mRNA相对表达高于正常宫颈组织组和宫颈上皮瘤变组，Tiam1蛋白阳性表达率高于正常宫颈组织组和宫颈上皮瘤变组，且Tiam1 mRNA高表达者复发率较高，Tiam1蛋白阳性表达者复发率较高，表明Tiam1基因和蛋白与子宫颈癌密切相关，且其表达越高，患者预后越差。分析原因为，Tiam1是普遍存在的二磷酸鸟嘌呤核苷酸（GDP）与三磷酸鸟嘌呤核苷酸（GTP）的转换因子，较少出现在脑和睾丸以外的组织，已被研究证实在胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达[5-6]。Tiam1作用于子宫颈癌的主要机制是通过作用于Rac1上游，其结构内的相关域同Ras产生相互作用，促进GDP和GTP相互转换，从而活化Rac1，促使细胞表面的整合素甲组迁移至细胞头部，并调节信号通路促进细胞骨架的活性和形态学改变和细胞运动，促进片状伪足和膜多极化，从而导致癌细胞侵袭浸润并发生转移[7-8]。另外，有研究表明，Tiam1刺激活化的Rac1可诱导MMPs活化，可活化多种外基质结构蛋白的活性，从而诱导肿瘤血管生成，为恶性肿瘤生长提供营养，同时，为癌细胞进入循环系统提供通道[9-11]。因此，Tiam1和恶性肿瘤的发展与预后密切相关，可为临床靶点治疗和预后评估提供依据。

综上所述，Tiam1基因在子宫颈癌组织中呈高表达，Tiam1蛋白在子宫颈癌组织中呈较高的阳性表达率，可参与子宫颈癌细胞的扩散，二者高表达将导致患者不良预后。