耐镉菌株L202002的分离鉴定及特性研究

李梦茜，黄惠彬，龙洁云，张振旺

(1.河池学院 化学与生物工程学院，广西 河池 546300；2.湖北科技学院 临床医学院，湖北 咸宁 437000；3.湖北科技学院 医药研究院，湖北 咸宁 437000)

重金属引起的环境污染日益受到关注，从受污染的土壤和水体中去除重金属对环境保护至关重要。目前，去除废水中重金属的方法主要有化学沉淀法、离子交换法、膜技术和生物吸附法等[1-2]。相较其他方法，生物吸附法具有成本低、无二次污染、操作简便等优点，受到广泛关注[3-4]。细菌[5-7]、霉菌[8-9]、微藻类[10-11]和酵母[12-13]均能产生吸附活性物质，可用于吸附去除重金属。目前关于微生物絮凝剂的大部分研究集中在微生物对重金属离子的吸附特性及耐受吸附机制等方面[14-15]。

抗重金属微生物的分离对于发挥微生物在环境保护中的作用具有重要意义。试验从镉污染河道底泥分离筛选出一株抗镉菌株，通过形态观察、生化生理特性和ITS序列分析，对该菌株进行了鉴定，并考察其絮凝活性和对重金属(镉、铜、铬、汞、铅、锌)的抗性，以期为用于从废水中去除重金属镉提供参考。

1 试验部分

1.1 试剂及设备

试验主要试剂：蛋白胨、琼脂粉、酵母粉，均为化学纯，西陇科学股份有限公司产品；硝酸、PbCl2、CdCl2、CuCl2、ZnCl2、K2Cr2O7、HgCl2、均为分析纯，国药集团产品；高岭土，化学纯，国药集团产品。

主要设备：火焰原子吸收分光光度计，WFX-110B型，广州赛福斯实验设备科技有限公司；恒温培养振荡器，ZWY1102C型，上海跃进医疗器械有限公司；酶标仪，xMark型，美国Bio-Rad公司；电子扫描显微镜，Phenom Pro X型，荷兰Phenom-World公司。

1.2 试验方法

1.2.1 耐镉菌株的分离筛选

从广西南丹县某矿区附近采集镉污染水体污泥样品。用去离子水溶解氯化镉制备浓度0.2 mol/L镉原液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。

LB培养基的组成：酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L。

将10 g污泥加入到90 mL灭菌水中，在磁力搅拌器上搅拌30 min，使土壤中的细菌完全分离。培养20 min后进行梯度稀释，取10-5、10-6梯度各100 μL分别涂布到含2 mmol/L Cd的LB固体培养基中，于温度30 ℃下培养4 d。挑取平皿中菌落形态不同的单菌落用划线法接种于分别含1～20 mmol/L Cd的固体LB培养基上，检测各菌株对Cd的耐受性。选择耐受最高Cd浓度的菌株进行后续试验。在固体培养基上挑取单个菌落并划线，反复上述操作直至得到纯化菌株。

1.2.2 菌株鉴定

首先观察菌株琼脂平板菌落形态、显微孢子形态。收集菌丝体,置于无菌研钵中，反复研磨后用基因组DNA提纯试剂盒提取基因组DNA，用通用ITS序列引物ITS-1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS-4(5’-CCTCCGCTTA-TTGATATGC)进行PCR扩增ITS基因片段[16]。扩增出预期大小的ITS序列(0.7 kb)的PCR产物，用凝胶提取试剂盒纯化后送上海生工公司测序。测序得到的ITS序列提交Gen Bank数据库，并与相似序列进行BLAST比对。用CLUSTAL W.软件构建系统发育树。

1.2.3 对其他重金属的抗性

最低抑菌浓度(MIC)是指完全阻止菌株生长的最低金属浓度。其他重金属CuCl2、K2Cr2O7、ZnCl2、HgCl2和PbCl2原液按照Cd原液配制方式配制(0.2 mol/L)。在LB琼脂平板上分别添加不同浓度的5种重金属溶液，将菌株划线接种于平板上。于30 ℃培养箱中培养3～5 d后，测定各重金属的MIC。用实验室保藏的白色念珠菌进行对照试验。

1.2.4 抗镉菌株的絮凝活性评价

用高岭土悬浊液测定菌株L202002的絮凝活性[17]。将1 mL菌株发酵液上清液、2.5 mL CaC12溶液(1%)、46.5 mL高岭土悬浊液(4 g/L)在离心管中混合，用磁力搅拌器搅拌并静置10 min，从离心管上层吸取2 mL上清液于24孔板中，用酶标仪测定550 nm处的吸光度(B)。用同样方式加入不含菌的LB液体培养基作为空白对照，测定550 nm处的吸光度(A)。同时加入市售聚丙烯酰胺絮凝剂作为阳性对照。絮凝率计算公式如下：

式中：μ—絮凝率，%；D1——对照组吸光度；D2—加入菌株发酵液的吸光度。

用SEM观察高岭土被絮凝前、后的形貌特征，阐明菌株的絮凝活性机制。

1.2.5 菌株的除镉性能评价

菌株对镉的去除性能用摇瓶进行初步测定。将9个装有100 mL LB液体培养基的250 mL摇瓶标记为1#～9#，分组如下：A组，1#～3#；B组，4#～6#；C组，7#～9#。A组的3瓶未接种，B组和C组的6瓶接种。9个摇瓶均放于温度30 ℃、 振荡速度180 r/min的摇床中振荡培养。培养48 h后，C组3瓶培养物在121 ℃条件下灭菌10～15 min，直至菌体几乎全部灭活。然后将CdCl2·6H2O加入到9个培养瓶中，得到Cd最终浓度为2 mmol/L。9个培养瓶继续放在摇床中培养24 h，每个培养瓶的培养物以5 000 r/min速度离心10 min，然后用火焰原子吸收分光光度计测定上清液中Cd浓度，计算Cd去除率(η)。

式中：c0—未接菌培养液中Cd浓度，mol/L；c1—接菌培养液中Cd浓度，mol/L。

2 试验结果与讨论

2.1 菌株的筛选与鉴定

从污泥中筛选抗镉菌株，经固体琼脂平板划线纯化，获得一批抗镉菌株，其中一株在含19 mmol/L Cd的琼脂平板上培养3 d仍有少量小菌落，当Cd浓度增至20 mmol/L培养7 d时，平板上无菌落形成。重复培养3次，菌株抗镉性能稳定。该菌株命名为菌株L202002。

2.1.1 L202002的培养与理化特征

L202002菌株在LB固体培养基上呈绒毛状、辐射状生长，菌落中央为土黄色(图1(a))；LB液体培养条件下形成菌丝球，菌丝绒毛状(图1(b))；孢子梗顶端分散着球形颗粒状分生孢子，显微镜下孢子呈黄绿色菊花样颗粒(图1(c))。碳氮源是构成微生物细胞的最重要的营养成分，利用和分解碳、氮源的能力是微生物重要的生理生化特征，在微生物的鉴别和分类时占有重要地位[18]。菌株L202002利用碳氮源的情况见表1，可以看出，L202002菌株的形态和理化特征与曲霉属较为一致。

a—平板菌落；b—液体培养菌丝球；c—镜检孢子形态(1 000倍)。图1 菌株L202002的培养特征

表1 菌株L202002的生化特征

2.1.2 菌株的ITS序列测序

对菌株L202002提取总DNA后送上海生工测序，ITS序列提交到Gen Bank数据库进行BLAST比对分析，结果表明，L202002与曲霉菌(Aspergillus)的ITS序列同源性在98%以上。为进一步确定菌株L202002与其他霉菌的亲缘关系，选取30株同源性较高的菌株构建基于ITS的系统发育树，结果如图2所示。

图2 L202002菌株基于ITS序列的系统进化树

可以看出：L202002与土曲霉(Aspergilluscejpii)位于同一分支上，具有较近的遗传距离。综合形态特征、生理生化特征和ITS序列分析，菌株L202002被鉴定为土曲霉。

2.2 其他重金属离子对菌株L202002的最低抑菌浓度(MIC)

菌株L202002可以在高浓度Cd、Cu、Cr、Hg、Pb、Zn培养基中生长。Cu、Zn是微生物必需的微量营养元素，其他元素Cd、Cr、Hg和Pb对细胞有致命作用，通常在微摩尔或毫摩尔浓度下具有毒性。菌株L202002对几种重金属Cd、Cu、Cr、Hg、Pb和Zn的MIC见表2。可以看出，菌株L202002对这几种重金属都有抗性，抗性顺序为Cd>Zn>Cu>Cr>Hg>Pb。菌株L202002对重金属的抗性远高于白色念珠菌。

表2 菌株L202002对几种重金属的MIC mmol/L

2.3 L202002菌株的絮凝性能

L202002菌株对高岭土悬浊液的絮凝效果如图3所示。可以看出，L202002菌株对高岭土悬浊液表现出很好的絮凝效果，与市售絮凝剂聚丙烯酰胺的絮凝效果相当。L202002菌株的絮凝活性产物在添加量为30 mg/L时对高岭土悬浊液的絮凝率高达100%。

a—高岭土悬浊液；b—加L202002菌液；c—加聚丙烯酰胺。图3 L202002菌株对高岭土悬浊液的絮凝效果

2.4 菌株L202002的絮凝机制

高岭土溶液絮凝前、后SEM分析结果如图4所示。可以看出，分散的高岭土细小颗粒被菌株絮凝活性产物通过架桥吸附作用像编织网一样紧密地连接在一起，并且易于与溶液分离。高岭土胶粒可以强烈地吸附在多糖絮凝剂分子链功能团上，且吸附在链上的胶粒可以同时被其他分子链吸附，产生架桥连接，从而形成容易沉降的三维絮体；在沉降过程中絮体相互碰撞和卷扫形成粗大的絮凝团，从而加速高岭土的沉降[19-20]，因此推断，菌株L202002絮凝活性产物主要是通过架桥吸附和网捕卷扫机制完成对高岭土颗粒的吸附。

图4 高岭土絮凝前(a)、后(b)的SEM图像

2.5 菌株L202002对溶液中Cd的去除

菌株L202002对Cd的去除效果见表3。可以看出：B组和C组平均Cd质量浓度明显低于A组，考虑到时间和能耗成本，以处理24 h为宜；与不接种菌株的A组相比，B组的平均Cd质量浓度下降162.2 mg/L，C组的平均Cd质量浓度下降138.4 mg/L，这表明菌株L202002具有良好的金属去除性能，活菌和死菌均能有效去除溶液中的Cd。

表3 菌株L202002对Cd的去除效果

研究重金属环境中微生物的生长情况对于治理重金属污染至关重要[21-22]。一般来说，微生物去除重金属的过程包括生物吸附和生物积累[23]。生物吸附过程是指微生物通过配合、螯合、离子交换、吸附等生化反应吸附金属离子，活细胞和非活细胞都有生物吸附作用；生物积累通常只发生在活细胞中，是一个活跃的过程，需要微生物新陈代谢提供能量。死菌在生物修复方面比活菌更好，因为死菌不会受金属毒性的影响[24]；但活细胞对金属的去除率要高于非活细胞对金属的去除率[25]。其原因可能是菌株对Cd的抗性较强，而Cd对菌株生命的影响较小。在吸附去除过程中，活细胞通过生物吸附和生物积累去除Cd，而非活细胞只能通过生物吸附来去除Cd。因此，活细胞对Cd的去除能力要好于非活细胞。

3 结论

1)分离得到的菌株L202002为土黄色绒毛状，孢子呈黄绿色菊花样颗粒，液体培养条件下形成菌丝球，被鉴定为曲霉菌Aspergilluscejpii。

2) 菌株L202002对Cd有较强的耐受性，对固体平板上的其他金属，如Zn、Cu、Pb、Hg也有较好的耐受性；并且，对高岭土悬浊液表现出很好的絮凝活性。

3) 菌株L202002的活细胞和非活细胞都能去除溶液中的Cd，经活细胞、非活细胞处理24 h后的Cd平均质量浓度分别下降162.2、138.4 mg/L，相应的Cd去除率分别为73.5%、62.7%。

4)由于菌株L202002对其他重金属亦有很好的耐受性，且对高岭土悬浊液有良好的絮凝活性，所以，进一步研究菌株的抗Cd机制及絮凝活性产物对重金属污染水的治理有一定意义。