高效液相色谱法测定奥培米芬片中奥培米芬的含量

钟浩，陶庭先，吴俊，丁正霞，崔海鞠，章靖芳

（宣城职业技术学院医护学院，宣城 安徽242000）

奥培米芬是一种有组织选择性作用的雌激素受体调节剂，通过与雌激素受体α和β结合，激活某些组织中雌激素通路和阻断其他雌激素通路，临床上用于治疗女性中至重度性交困难，以缓解一些女性因绝经期激素水平下降导致的外阴和阴道内萎缩［1-3］。该药物上市剂型为片剂，商品名：OSPHENATM，规格60 mg，目前尚未见在中国生产或进口。各国药典 （Ch.P、BP、USP、JP、E.P.）均未收载。关于奥培米芬的专利对其化合物、合成方法、剂型及质量控制均申请了相应的保护。本研究通过参考类似药物（如雷洛昔芬）的含量检测方法［4-5］，不断地改进和探索，开发了一个合理的、有效的测定奥培米芬片中奥培米芬含量的方法，现进行方法验证，以补充国内对奥培米芬片质量控制方法学的研究成果。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。奥培米芬对照品（批号F-061622，纯度99.9%）、杂质G（批号JF-061622-G，纯度99.9%）、杂质E（批号JF-061622-E，纯度99.9%）、杂质H（批号JF-061622-H，纯度99.9%） （美国QCC公司）；奥培米芬片（批号011531、011506）（日本野义制药公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18（2） （250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，检测波长254 nm，柱温30℃，流速1.0 ml／min，进样量20μl，运行时间30 min，水（磷酸调pH为3.0）-乙腈-甲醇溶液（25∶37.5∶37.5）为流动相。

2.2 对照品溶液的制备 取奥培米芬对照品适量，用甲醇定量稀释制成每1 ml含奥培米芬50μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品研细，取适量（约相当于奥培米芬10 mg），精密称定，置于200 ml容量瓶，加甲醇适量，超声10 min，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 测定溶剂（甲醇）、供试品溶液（含奥培米芬50μg／ml）、杂质G定位（1 μg／ml）、杂质E定位（1μg／ml）、杂质H定位（1μg／ml）、系统适用性溶液（含奥培米芬50 μg／ml、杂质H 1μg／ml），按色谱条件注入色谱仪中测定，溶剂不干扰测定，杂质与主成分完全分离，不干扰测定，专属性强。结果见图1、图2，系统适应性数据见表1。

图1 分离度试验HPLC图

图2 系统适用性试验HPLC图

表1 系统适用性数据

2.4.2 滤膜吸附试验 取本品细粉 （批号011531），约39 mg，精密称定，置于200 ml量瓶中，加入甲醇适量，超声10 min用流动相稀释至刻度，摇匀，分成2份，1份用微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液；另1份离心，取上清液。另取对照品溶液过滤，考察滤膜对本品含量测定的影响。结果表明：对照品溶液过滤前后及供试品溶液过滤与离心，峰面积及比值无明显差异，表明本法供试品溶液可采用微孔滤膜（0.45μm）过滤。见表2。

表2 滤膜吸附数据

2.4.3 重复性 取同一批样品（批号011531），精密称定，配制6份供试品溶液，在上述色谱条件下测定含量。结果奥培米芬的RSD值为0.52%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 溶液稳定性 取奥培米芬供试品溶液，室温避光放置，在上述色谱条件下于0、2、4、6、8、12 h测定：结果奥培米芬峰面积RSD值为0.06%，表面供试品溶液室温避光放置12 h内稳定。

2.4.5 线性 取奥培米芬对照品约10 mg，精密称定，置于同一20 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液母液。分别精密量取线性溶液母液1、2、2、5、3、5 ml，分别置于50、50、25、50、25、25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为各相关线性溶液，分别取上述溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度X（mg／ml）和峰面积Y（A）进行线性回归。计算回归方程，回归方程为Y＝64 289.198X-2.764（r＝1.000，n＝6），结果表明奥培米芬在0.010 1～0.100 7 mg／ml范围内呈良好的线性关系，结果见表3。

表3 线性范围试验结果

2.4.6 回收率试验 供试品溶液：取本品（批号011531）研细，取适量（约相当于奥培米芬10 mg），精密称定，置于200 ml容量瓶，加甲醇适量，超声10 min，用甲醇稀释至刻度。

对照品溶液：精密称取奥培米芬对照品约10 mg，置于20 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密量取1 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容，作为对照品溶液。

加标供试品溶液：按80%、100%、120%3个浓度梯度，分别向供试品溶液中精密加入奥培米芬对照品40、50、60μg，每个浓度3份样品。结果见表4，结果表明回收率良好。

表4 回收率试验结果

2.4.7 耐用性 取系统适用性溶液、奥培米芬供试品溶液，考察在不同柱温、检测波长、色谱柱、缓冲盐的pH值、流速的条件下对含量检测的影响。结果表明：试品溶液分别在改变温度、缓冲盐的pH值、流速、流动相比例、检测波长及不同色谱柱的条件下，主峰拖尾因子在0.9～1.1之间，含量测定结果变化很小，塔板数均大于9 000，说明本法的耐用性良好。

2.4.8 不同批次样品测定 取本品2个批号，按“2.3”项下方法制备样品溶液，各取20μl进样，测定含量，每个批号配制3个，测3次，取平均值，结果样品 （批号011531） 含量分别为99.8%、99.6%和99.2%，平均含量99.5%；样品（批号011506）含量分别为99.4%、99.6%和99.4%，平均含量99.4%。

3 讨论

奥培米芬作为新一代的雌激素受体调节剂，在2013年获得美国FDA批准上市，因此该药物还在专利保护阶段，药品标准只有企业标准，各国药典均未收录此药物的含量测定方法，所以本研究选取该药也是为了探究一个适合准确的方法测定奥培米芬的含量。

基于目前含量测定多采用HPLC来测定，本研究也采取HPLC来测定奥培米芬片中奥培米芬的含量，在药品的含量测定当中，样品的前处理方法尤为重要，样品处理后其目标成份误差应该符合规定，回收率要符合规定，所以本研究考察了奥培米芬对照品溶液微孔滤膜过滤前后及供试品溶液过滤与离心后其目标峰的峰面积，并计算RSD。实验证明奥培米芬溶液过滤后目标成分误差符合规定，因微孔滤膜过滤法使用简单、快捷、无毒卫生，适合快检。所以本试验样品拟采用微孔滤膜过滤［6-8］。

在药品的含量测定中仪器参数的变化很可能会对测定结果产生影响，所以本研究考察了在不同柱温、检测波长、色谱柱、pH值缓冲盐、流速的条件下对奥培米芬含量检测的影响，结果表明：试品溶液分别在改变温度、pH值、流速、流动相比例、检测波长及不同色谱柱的条件下，主峰拖尾因子在0.9～1.1之间，含量测定结果变化很小，塔板数均大于9 000，说明本法的耐用性良好。方法通过验证。