生殖道衣原体质粒功能的研究进展

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(1.南华大学衡阳医学院病原生物学研究所 特殊病原体防控湖南省重点实验室，湖南省衡阳市 421001； 2.德州大学圣安东尼奥健康科学中心 微生物免疫与分子遗传学实验室，美国德克萨斯州 78229)

衣原体是一种特殊的细胞内寄生的革兰阴性菌，具有双相发育周期，在细胞外表现为具有传染性的原体(elementary bodies,EB)，在细胞内表现为代谢活跃的网状体(reticulate bodies,RB)[1]。衣原体属目前公认的有11个种[2]，其感染的宿主范围广泛，能引起人类和动物的多种疾病。其中，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起女性感染者的宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎等，感染反复迁延，引发输卵管慢性炎症，并继发管腔粘连、狭窄甚至闭锁，形成输卵管积水，最终导致输卵管阻塞性不孕，给广大女性和家庭带来沉重的精神压力和经济负担[3]。用鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)在小鼠构建生殖道感染的模型是目前研究Ct与宿主生殖道相互作用的常规方法[4]。这类与生殖道感染致病有关的衣原体通常包含有衣原体重要的毒力物质——质粒[5]。质粒除了与衣原体的毒力和致病性有关外，还对衣原体自身生长代谢、诱导机体免疫应答作用均具有影响。本文对生殖道衣原体质粒的主要功能及其潜在应用价值作一概述。

1 衣原体质粒的基本特征

质粒是细菌中除染色体DNA外能自主复制的DNA分子。衣原体的质粒为环状双链DNA，大小约为7.5 kb，存在于染色体外，质粒在衣原体RB二分裂阶段能达到最多拷贝数，以便将质粒有效分配于子代衣原体中[6]。生殖道衣原体为非接合性质粒，不编码衣原体抗生素耐药性，且不具备整合能力[7]。Szabo等[8]发现，所有衣原体的祖先均携带质粒，随着时间的推移质粒会产生不同的变异。但是，不同衣原体的质粒，遗传相似性为69%～99%[7]。Cm与Ct感染人体的D型菌株有超过90%的基因相似性，两种衣原体质粒基因均含有非编码RNA与8个开放阅读框(open reading frame,ORF)，分别编码8个质粒蛋白pGP1-8[9-10]。小鼠阴道接种Cm导致的生殖道感染也与Ct在女性生殖道引起的感染非常相似。因此，Cm的质粒功能在某种程度上可以反映Ct的质粒功能。

2 衣原体质粒的致病性

随着小鼠模型和质粒缺失株的应用，衣原体质粒在致病性方面的研究有了新的进展。Hou等[11]比较了Cm质粒缺失株与质粒携带株在BALB/c小鼠中的感染情况，发现经阴道接种Cm质粒携带株的小鼠出现输卵管积水，而接种Cm质粒缺失株的小鼠未出现明显病变；甚至将Cm质粒缺失株直接注射到小鼠输卵管内依旧不能诱发输卵管积水；同样，Ct质粒缺失株在小鼠泌尿生殖道中的感染力及毒力与质粒携带株相比也显著降低[12]。这些结果表明，质粒在衣原体的发病机制中发挥关键作用，可能与衣原体引发宿主炎症反应并诱发输卵管病变显著相关。此外，质粒在衣原体定植胃肠道时也发挥重要作用。Cm能够感染小鼠生殖道，然后通过血液途径传播至胃肠道，Shao等[13]发现与质粒携带株相比，Cm质粒缺失株接种小鼠生殖道后扩散并定植于胃肠道的时间明显延迟，且胃肠道的衣原体载量显著减少，甚至通过静脉接种或胃部接种也不能使Cm质粒缺失株正常定植于胃肠道，因此质粒还可能在衣原体生殖道感染向胃肠道扩散、定植过程中发挥重要作用。Ma等[14]通过将Cm质粒携带株与质粒缺失株感染小鼠胃肠道不同部位发现质粒或许能够通过不同的机制提高衣原体在肠道不同位置的适应性。

衣原体质粒的8个ORF编码8个质粒蛋白(pGP1-8)，其中pGP3是唯一的分泌蛋白。研究者在Cm感染的小鼠模型中发现pGP3是衣原体诱发输卵管炎症及阻塞的重要毒力因子[15-16]。Ramsey等[17]也发现pGP3缺乏的Ct L2型感染小鼠生殖道后引发炎症反应的能力减弱。除生殖道外，Cm也能感染小鼠肠道并实现长期稳定的定植[18]，文献[19-20]使用pGP3缺失的Cm经不同途径感染小鼠，发现pGP3能够使衣原体通过胃黏膜屏障从而定植于胃肠道。Huo等[21]在小鼠模型中发现，仅缺乏pGP3的衣原体或许能够激活肠道对衣原体传播的调控。在衣原体感染过程中，EB会暴露在细胞外的黏膜环境中，许多黏膜效应因子对EB具有杀伤作用，pGP3能够抑制多种效应因子的抗衣原体活性从而使子代EB安全地感染下一个宿主细胞，例如，在小鼠和非人类灵长类动物感染模型中，被感染的输卵管上皮细胞裂解的细胞质中释放的pGP3能够抑制抗菌肽对衣原体的杀伤作用，通过靶向作用于抗菌肽，破坏固有免疫从而实现衣原体的持续性感染。该结果证明pGP3对衣原体有效免疫逃逸，并在宿主建立持续性感染中至关重要[22-24]。Ct能够通过多种机制调控宿主细胞死亡的信号通路，以确保完成自身生长周期，例如，Lei等[25]发现Ct的pGP3或许能够上调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达调控线粒体的自噬与凋亡，从而调控细胞凋亡。Zou等[26]发现PI3K/AKT介导的MDM2-p53通路的激活在抵抗Ct感染引起的细胞凋亡中发挥重要作用，而Ct的pGP3能够作用于该通路从而抑制HeLa细胞凋亡。

Song等[9]发现，pGP4是pgp3与多种染色体基因的转录调控因子，包括糖原合成酶基因glgA。由于pGP4缺失导致pgp3等多种基因表达改变，因此很难确定pGP4除了调控表达外的其他功能。细胞实验中发现质粒缺失的Ct L2血清型刺激宿主产生炎症因子的能力降低，但不能确定该性状的出现是由于缺失pGP3或者pGP4的结果[27]。此外，拥有质粒的衣原体能够向邻近细胞扩散，而无质粒的L2血清型衣原体只能产生滞留在细胞内的包涵体。该性状可能是由于pGP4的缺失造成[28]。Zhang等[29]发现pGP4能够通过作用于EUO调控衣原体RB到EB的转变，从而调控衣原体转录过程。

缺失pGP5的Ct L2血清型不会明显影响其受质粒调控的染色体基因的表达，将Cm的pgp5基因敲除或替换为mCherry基因，导致受质粒调控的基因表达显著增高，包括tc0319，tc0181，tc0419，tc0420，tc042以及tc0357[30]。这些结果表明pGP5可能是Cm的负转录调控因子，而这些基因受到pGP4的正向调节。

过去研究者认为pGP8对于质粒的维持有重要作用[9]。Gong等[31]发现质粒在L2型的Ct中依然维持稳定，证实维持质粒所必需的是pgp8基因序列而不是pGP8蛋白。此外，pgp8基因还编码一种反义小RNA，命名为sRNA-2。在所有Ct质粒ORF中，sRNA-2的表达最为丰富，表明sRNA-2在调节pgp8中发挥重要作用[32]。

pGP7的缺失在Ct L2型和Cm中都没有引起任何显著差异。此外，pGP7缺失的Cm诱导的输卵管积水与Cm质粒完整株诱导的输卵管积水同样严重。因此，pgp7缺失的衣原体可以作为致病机理研究的对照菌株。另外，由于pgp1、pgp2或pgp6基因的缺失会导致质粒的维持功能受到影响，因此难以评价它们在衣原体致病性中的作用[31]。

3 质粒对衣原体生长周期的影响

质粒能够通过调节染色体基因的表达从而影响衣原体的生长周期。Skilton等[33]通过比较携带质粒与无质粒的Cm在McCoy细胞中的生长性状及包涵体形态，证实了质粒缺失是影响衣原体生长及其染色体基因复制的重要原因。Gong等[31]发现Ct和Cm质粒可调节衣原体多个染色体基因的转录，Ct质粒缺失导致糖原合成基因表达下降，使包涵体缺乏对于衣原体生存具有重要意义的糖原积累，表明质粒可能通过调控基因表达影响衣原体生长。Yang等[34]构建了质粒pGP1-8基因缺失的Ct L2型转化株，通过进行空斑形成实验和衣原体释放抑制实验发现衣原体空斑形成能力依赖于pGP4，通过pGP4调控F肌动蛋白的解聚促进衣原体释放，从而启动新的感染周期，最终引起空斑形成。

4 衣原体质粒的应用价值

研究者通过动物实验发现，无质粒衣原体菌株可作为潜在的衣原体减毒活疫苗，预防衣原体感染引起的病变[31]。O’Connell等[35]利用小鼠模型对Cm质粒缺失株的免疫保护作用进行了检测，发现接种了Cm质粒缺失株的小鼠未发生生殖道病变，且再次感染野毒株时，小鼠产生了相应的保护性免疫。以Ct L2型的质粒缺失株阴道感染小鼠，发现其在小鼠体内诱导了针对衣原体的保护性免疫，该作用不会引起小鼠输卵管病变，且小鼠再次感染衣原体野毒株时阴道感染载量显著降低[36]。以上结果均证明无质粒衣原体菌株有望发展为有效的减毒活疫苗。

此外，将质粒编码的免疫优势抗原pGP3免疫小鼠后，可使小鼠产生保护性免疫[17]。人血清抗体通过pGP3的三聚体结构识别该蛋白，该结构由一个C端结构域、一个N端结构域以及一个三螺旋中间结构域(pGP3m)组成，该结构可能使pGP3在衣原体引起的免疫应答中发挥重要作用，使得pGP3或许能够成为潜在的衣原体疫苗[37]。

5 总 结

质粒是否含有与表型有关的功能基因决定了质粒的功能。衣原体质粒编码多种毒力因子，同时也调节衣原体染色体中基因的表达，使得质粒在衣原体中发挥着关键的作用，促进衣原体以更好的生存优势和抗胁迫能力应对外界环境。对质粒ORF功能的进一步研究不仅能够促进对衣原体致病机制的了解，更能加速衣原体疫苗研究的进展。随着衣原体生物学和各种基因工程技术的发展，人们将更加全面深入地了解衣原体致病的分子机制，从而使生殖道衣原体的质粒在其疫苗研制及应用中发挥更大的效益，并研制出衣原体感染的靶向治疗方法，更好地造福人类健康。