液体活检技术在肿瘤诊断中的最新研究进展

夏艳艳，沈 瀚，许红攀，李智洋（南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008）

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率居高不下[1]。由于肿瘤早期症状隐匿且多样化，很多患者在首次诊断时已属肿瘤晚期[2]。癌症的预后与病程有着密切关联，临床研究表明，原位癌治愈率达90%以上，I 期癌症患者的5年生存率达60%～90%，II 期患者的5年生存率约50%，而III b 和IV 期患者的5年生存率仅5%～20%，提示早期发现、诊断是改善肿瘤预后的关键[3]。因此，如何提高肿瘤早期诊断水平已成为肿瘤防治工作中面临的紧迫任务。

目前肿瘤的诊断技术主要包括肿瘤标志物、计算机断层摄影（computed tomography,CT）、组织活检。肿瘤标志物检测虽然操作简单，但是其诊断的特异度和敏感度很低，只有30%和18%～70%[4]。虽然CT 针对早期肿瘤检出率能达到40%～60%，但其假阳性率较高（达到50%以上），常导致患者过多的辐射暴露和沉重的心理负担，甚至不必要的手术带来的身体及经济负担[5]。组织活检是确认的金标准，但是有创的侵入性操作会对患者造成生理负担和心理影响，同时由于其只能针对少数部分进行取材，穿刺活检也未必能获得准确性信息[6]。因此发展敏感度及特异度更高，更加精准、无创、简便地肿瘤早期筛查技术是临床亟待解决的重大科学问题。

液体活检是对患者外周血液进行检测分析，获得患者肿瘤相关信息的一项新兴技术，主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA,ctDNA）和外泌体。液体活检具有操作方便快捷、能反复获取、易于实时监控等优点，为肿瘤的早期诊断提供了新方法。以下就液体活检技术在肿瘤早期诊断中的应用价值以及存在的优势和局限性进行综述，以期为肿瘤患者早期诊断提供新方法。

1 液体活检中CTC 在肿瘤诊断中的应用

CTC 是肿瘤细胞从原发部位分离，进入血液循环，并可以通过血液循环播散并进行远处转移。研究表明，CTC 在肿瘤直径＜ 0.1 cm 时就已表现出异常，在时间上比传统影像学早6～9 周[7]。YU 等[8]通过磁珠富集CTC，再标记肿瘤特异度配体叶酸进行PCR 检测，结果显示该方法诊断非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的敏感度为73.2%，特异度为84.1%，但是对I 期NSCLC 患者的诊断敏感度只有67.2%，仍旧有1/3 的漏诊率。这主要是由于CTC 在血液中的含量极低（一般患者10 ml 血液中只有1～10 个CTC）、半衰期短所致，此外目前缺乏可用的特异度标志物来识别CTC，容易出现假阳性和假阴性的情况[9]。

2 液体活检中ctDNA 在肿瘤诊断中的应用

ctDNA 也是肿瘤诊断中研究的热点。深度测序检测ctDNA 显示[10]，在72%的患者中，ctDNA 可早于影像学5.2 个月检测到肿瘤，并且在首次治疗后检测复发率的准确度达到94%。早期肿瘤患者ctDNA 等位基因移位和杂合性丢失频繁发生，因此检测ctDNA 能够发现肿瘤早期基因的改变[11]。但是ctDNA 代表的是死细胞的信息[12]，半衰期仅有2 h[13]；而且含量低，约占整个循环DNA 的1%，甚至只有0.01%[14]，分离不当还会造成背景值过高，而影响检测的灵敏度。

3 液体活检中外泌体在肿瘤诊断中的应用

3.1 外泌体作为肿瘤标志物的优势 外泌体可以在细胞间转运癌基因和蛋白质，在肿瘤形成、生长、转移和耐药中起到关键作用[15]。作为肿瘤标志物的优势体现在：①数量多，在血清中外泌体浓度可达到3×106个/μl[16]，平均每个肿瘤细胞可释放530个外泌体/24 h[17]；②信息丰富，非常类似于肿瘤细胞。外泌体膜表面也有着和细胞膜同样的蛋白，可以代表其亲本细胞的特征和状态[18]；③易于长期保存和去除干扰。半衰期长，有磷脂双分子层的保护而不被蛋白酶和核酸酶降解，并且只要分离外泌体就可以去除干扰[19]；④无创检测。外泌体可以穿过内皮进入循环系统，因此在几乎所有的体液中可以检测到[20]，与组织活检相比，外泌体是个性化医疗的有效生物标志物。

外泌体相关蛋白、miRNA 等都可以作为肿瘤检测的标志物。采用表面增强拉曼光谱对肺癌患者外泌体进行分析，结果显示该方法区分肺癌和正常人外泌体的敏感度为95.3%，特异度为97.3%[21]，但表面增强拉曼光谱需要特定的设备，而且仪器环境轻微震动会导致光学检测结果出现较大偏差。VANNII 等[22]研究发现肺癌患者血液外泌体来源的miR-25 和miR-223 的表达水平较正常人升高，而1et-7f，miR-20b 和miR-30e-3p 的表达水平前者较后者明显降低，这种差异性表达为肺癌的诊断带来潜在应用价值。因此，对肺癌患者的外泌体进行检测，将为肺癌患者的诊断提供更加科学的工具。然而目前针对外泌体miRNA 肿瘤标志物的检测都是连同正常外泌体miRNA 一起分析的，导致少量的肿瘤外泌体中过表达miRNA 信号常被噪声淹没[23]。而外泌体膜表面蛋白反映其来源细胞的特征和状态，可借助亲和结合直接特异检测，因此发展以肿瘤外泌体表面特异蛋白为靶标的检测方法具有重要意义。

3.2 以外泌体表面蛋白为靶标的检测方法进展 传统检测方法如蛋白印迹和酶联免疫法，操作复杂,敏感度极低，不适合临床推广[24]。为了解决这些问题，ZONG 等[25]采用磁珠捕获外泌体，再与结合在纳米棒上的探针相结合，利用表面增强拉曼散射检测肿瘤来源外泌体；ZHAO 等[26]利用微流控芯片实现了外泌体表面多个蛋白的同时检测；JEONG等[27]采用磁珠直接捕获血清中的外泌体，利用电化学法分析了多种蛋白质；DOLDAN 等[28]报道了一种基于电化学“三明治”免疫夹心的方法，用来定量检测外泌体。

核酸适配体（aptamer）具有与抗体相似的高亲和性，特异度高，识别能力强，可以特异地将肿瘤外泌体与正常外泌体区分开[29]。XIA 等[30]将针对CD63 蛋白的Aptamer 整合到单壁碳纳米管上，利用可视化的比色反应来检测乳腺癌来源外泌体；ZHOU 等[31]将外泌体CD63 蛋白特异性Aptamer 固定在金电极表面并整合到微流体装置上，利用电化学生物传感器定量检测肝癌外泌体；JIANG 等[32]利用金纳米粒子和外泌体竞争性的与Aptamer 结合，导致金纳米粒子的聚合或者解聚，从而形成可视化的比色反应来检测外泌体；CHEN 等[33]基于荧光共振能量转移Aptamer 传感，将外泌体固定在上转换纳米粒子和金纳米棒之间进行检测；WANG 等[34]报道了一种增强电化学Aptamer 传感器，它利用DNA 纳米四面体结构捕获Aptamer，并固定在金电极上，在加入外泌体后发生氧化还原反应，并通过K3[Fe(CN)6]/KCl 覆盖住整个电极来产生信号放大，纳米四面体结构有效地阻止了Aptamer 在电极上容易聚集、缠结的现象，因此在检测外泌体时可产生更强、更稳定的检测信号。表1 总结了外泌体的检测方法。

表1 外泌体表面蛋白检测方法

4 总结和展望

肿瘤的早期诊断对肿瘤的预后和5年生存率有着重要作用，然而目前的早期诊断技术难以满足临床需求。液体活检技术作为无创的新兴的肿瘤检测方法，在肿瘤的早期诊断、预后监测中都有重大的临床价值。外泌体与CTC,ctDNA 都属于液体活检的重要组成成分，但是外泌体具有分布广泛、来源于活细胞、分离鉴定相对简单等优点，受到越来越多的关注。虽然外泌体在肿瘤诊断中有巨大应用价值，但仍存在很大的探索空间。目前外泌体诊断研究的标本量较少，仍需大样本、多中心的临床研究。而且外泌体表面蛋白的检测方法大都是利用亲和分子特异性结合后进行检测，因此在应用该类方法进行临床检测时，比肿瘤来源外泌体多很多的正常外泌体会竞争性地占据捕获分子，导致无法结合肿瘤来源外泌体，而使检测灵敏度降低，因此如何保证所有肿瘤来源外泌体均能与特异的识别分子结合，对肿瘤的早期筛查具有非常重要的意义。同时将外泌体与肿瘤相关的其他检测指标联合检测，或许能取得更好的诊断效能。