替加环素与临床常用抗生素对碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌体外联合药敏试验

贾艳增，时东彦（河北医科大学第二医院检验科，石家庄 050017）

肺炎克雷伯菌是呼吸科常见的条件致病菌[1]，特别是呼吸科重症监护病房及呼吸机辅助呼吸，可引起严重的肺部感染、尿路感染甚至血流感染。然而，近年来高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumonia,HvKP）是一种日益被认识的病原菌，在呼吸科比较多见，比普通的肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumonia,cKP）更具有毒性，可导致健康的年轻人致病，包括肝脓肿、肺炎、脑炎等严重的社区获得性感染，具有侵袭性[2-3]。在过去的观点认为HvKP 很少对抗生素产生耐药性，除了天然耐药氨苄西林,大多数菌株对常用药物均敏感。然而，目前HvKP 出现多重耐药，特别是碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌株的报道不断增加，在中国，CR-HvKP 出现可达15%[4]。CR-HvKP由碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae,CRKP）获得pLVPK 样毒力质粒或HvKP 获得碳青霉烯耐药基因而形成且可在细菌之间快速传播[5-6]。CR-HvKP 具有高毒性、耐多药和传播性的特点称为真正超级细菌，给临床治疗和医院感染控制带来巨大的挑战。CR-HvKP 感染的药物极其有限且治疗效果差，预后不良。替加环素是临床上用于泛耐药的革兰阴性杆菌，目前临床上治疗CR-HvKP 的常用抗生素，但文献报道单独使用替加环素使其敏感性降低疗效差[7]。本研究评价替加环素联合临床常用抗生素对抗CR-HvKP 的效果，为临床治疗CR-HvKP 感染提供较佳的方案。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集河北医科大学第二医院2017～2019年临床分离非重复CR-HvKP 菌20 株，分别来自血培养15 株，腹腔引流液5 株。

1.2 仪器与药品 全自动微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司Vitek2 Compact），聚合酶链反应（PCR）扩增仪（美国Bio-Rad 公司），凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司），电泳仪（上海康华公司），细菌DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），2×Taq Master Mix（北京康为科技有限公司），50×TAE 缓冲液（上海生工有限公司）。哥伦比亚血琼脂、MH 培养基、MH 肉汤培养基(Oxoid 公司)，抗生素标准品：替加环素(大连美仑生物技术有限公司)，多黏菌素（大连美仑生物技术有限公司），头孢哌酮钠/舒巴坦钠（辉瑞制药有限公司），美罗培南(中国食品药品检定研究院)，阿米卡星(中国食品药品鉴定研究院)，磷霉素(中国食品药品鉴定研究院)。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定及微量肉汤法药敏试验：采用法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪Vitek2 Compact 进行菌株鉴定及药敏试验,药敏结果判定标准参照CLSI 2016年进行药敏结果判读；质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603，大肠埃希菌ATCC25922。按照CLSI 标准进行微量肉汤稀释法测定药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitiory concentration,MIC)值，参照CLSI 标准判定，头孢哌酮钠/舒巴坦钠及替加环素折点参照美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)判读，其中替加环素折点为敏感（S）：MIC ≤2mg/L，耐药（R）：MIC ≤8mg/L。

1.3.2 高黏液表型检测：采用拉丝试验方法，用接种环挑取哥伦比亚血琼脂平板上新鲜菌落进行牵拉，重复两次或两次以上，黏液丝形成且长度≥5mm 则判断为高黏液表型阳性，黏液丝形成且长度＜5mm判断为阴性。

1.3.3 高毒力肺炎克雷伯菌菌株：参照文献[8-9]资料，采用PCR 检测rmpA/rmpA2 毒力基因、铁载体毒力基因iroN，iutA，iucA，碳青霉烯酶基因（KPC-2，NDM-1，OXA，VIM 和IMP），血清型（K1，K2）。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌株的确认：参考文献[10]，拉丝试验与rmpA/rmpA2 基因均为阳性确定为HvKP。

1.3.5 多位点序列分析（MLST）：参考文献[10]，通过对肺炎克雷伯菌7 个管家基因进行扩增测序，采用Bioedit 软件数据进行分析确定ST 型。

1.3.6 联合药敏试验采用96 孔：微量棋盘稀释法检测替加环素和7 种常用抗生素联合检测对CRHvKP 的体外抗菌活性。药物浓度包含敏感、中介、耐药的折点。部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration,FICI)=(联合时A 药的MIC/单用时AMIC)+(联合时B 药的MIC/单用时B 药MIC)。

1.3.7 结果判读：FICI 判断标准：FICI ≤0.5 为协同作用，0.5＜FICI ≤1 为相加作用，1＜FICI ≤2 为无关，FICI＞2 为拮抗。

2 结果

2.1 20 株CR-HvKP 分子生物学及临床特征 见表1。20 株CR-HvKP 菌主要来自呼吸ICU 13 株，所占比例为65%,气管插管辅助呼吸16 例，所占比例为80%，血清型12 株为K2 型，所占比例为60%，1 株为K1 型，所占比例为5%。20 株CR-HvKP 均为ST11 型。拉丝试验及毒力基因rmpA2 均为阳性。毒力基因entB 及yetS 均为阳性。铁载体毒力基因iroN，iutA，iucA 分别为16 株，19 株，7 株，20株CR-HvKP 菌碳青霉烯酶基因均为KPC-2 型。

表1 20 株CR-HvKP 菌分子生物学及临床特征

2.2 20 株CR-HvKP 临床常用抗生素MIC 值 见表2。20 株CR-HvKP 微量肉汤稀释法检测对替加环素MIC 在0.125～1.0mg/L 范围，均敏感；多黏菌素MIC 在0.125～1.0mg/L 范围，均敏感；头孢哌酮钠/舒巴坦钠、美罗培南、阿米卡星、磷霉素钠均耐药。

表2 20 株CR-HvKP 临床常用抗生素MIC 值(mg/L)

2.3 替加环素联合临床常用药对20 株CR-HvKP的药敏结果 见表3。替加环素与临床常用抗生素联合药敏结果显示，替加环素与多黏菌素出现协同作用，百分比为60%。4 种抗生素与替加环素出现相加作用，分别为多黏菌素B 30%，头孢哌酮钠/舒巴坦钠30%，美罗培南10%，阿米卡星50%。5 种抗生素与替加环素为无关作用，分别为多黏菌素B 70%，头孢哌酮钠/舒巴坦钠70%，美罗培南90%，磷霉素钠80%，阿米卡星50%。磷霉素钠与替加环素出现拮抗作用为20%。

表3 替加环素联合临床常用抗生素对20 株CR-HvKP 联合药敏结果[n（%）]

3 讨论

过去观点认为HvKP 很少对抗生素产生耐药性，除了天然耐药氨苄西林,大多数菌株对常用药物均敏感，但近年来研究发现HvKP 存在多种结合和整合元素，使毒力基因/耐药基因在细菌之间通过质粒传播[11-14]。目前，主要有两种途径形成CR-HVKP:一种是碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）通过质粒获得毒力基因而形成CR-HvKP；另一种为HvKP 通过质粒获得碳青霉烯酶基因形成的[13]，且可以在细菌之间快速传播[6,14]。CR-HvKP具有高毒性、耐多药和传播性的特点被称为真正超级细菌，给临床治疗和医院感染控制带来巨大的挑战，因此需要迫切的对这种新型菌进行联合药敏试验，给临床提供更好的治疗方案是十分必要的。

本研究收集的CR-HVKP 20 株，以黎斌斌等[10]文献为参照，拉丝试验与rmpA/rmpA2 基因均为阳性确认为高毒力肺炎克雷伯菌，研究结果显示，20株均为rmpA2 毒力基因阳性。本研究中，K2 是CRHvKP 菌主要血清型，所占比例达60%，与SIU 等[15]报道类似。20 株CR-HvKP 菌均为ST11 型，碳青霉烯酶基因均为KPC-2型，与DONG等[16]报道相似。本研究主要出现血清型为K2，碳青霉烯酶基因为KPC-2 型ST11 的CR-HvKP。

本研究中使用了替加环素与临床常用治疗CRKP的5 种抗生素进行组合。研究发现，替加环素与多黏菌素对产生KPC-2 的CRKP 菌存在协同作用百分比较高，与TOLEDO 等[17-19]研究基本类似。POURNARAS 等[20]研究发现，体外药敏试验中与碳青霉烯类药物完全没有协同作用，本研究结果与其一致，替加环素与美罗培南对产生KPC-2 的CRKP 菌没有协同作用同时也没有拮抗作用，这与TOLEDO 等[17]报道的结果一致，但是ZHANG 等[18]报道是替加环素与美罗培南联合使用时确实有拮抗作用，这有待于进一步研究。同时本研究结果显示，替加环素联合头孢哌酮钠/舒巴坦钠、阿米卡星，磷霉素对抗产KPC-2 的CR-HvKP 菌感染体外试验无协同作用，而ZHANG 等[18]报道是替加环素与阿米卡星联合使用时有协同作用。

CR-HvKP 感染是复杂的，通常携带多种耐药基因，限制了治疗效果，目前，只有多黏菌素、替加环素、头孢他啶/阿维巴坦等药物仍具有较好的体外抗CR-HvKP 活性，而多黏菌素存在潜在的肾毒性限制了其广泛应用，尤其是肾功能不全的患者。头孢他啶/阿维巴坦作为新的药物在逐渐上市，临床抗CR-HvKP 感染疗效还未能全面评估且只抑制碳青霉烯酶A 类和C 类，对B 类无抗菌活性。临床上目前对于治疗CRKP 菌感染只有少数的抗生素，其中替加环素、多黏菌素和美罗培南经常用于联合治疗抗感染[21]。然而，最推荐的治疗方案以及应该使用哪种抗生素联合治疗CR-HvKP 至今也没有共识[22]。替加环素在中国已被批准用于临床，被认为是用于难以治疗的碳青霉烯耐药菌感染的最后手段[23]。然而，近几年来，替加环素出现了耐药性。DU等[24]报道替加环素耐药由tetA 突变基因通过质粒介导产生的。LIU 等[25]报道了多黏菌素也出现了mcr 突变基因通过质粒介导产生耐药。文献报道多黏菌素联合用药可以减少耐药性发展，这已在体外研究中得到证实，但未得到临床研究的支持[26]。因此，替加环素联合多黏菌素抗CR-HvKP 菌感染表现出最大的体外协同杀菌作用，本研究结果与其基本相似，该方案可作为治疗CR-HvKP 菌感染的最后手段。

CR-HvKP 具有高侵袭性、强致病力以及高耐药限制了临床有效药物治疗，使临床面对治疗CRHvKP 感染相当的困难，造成CR-HvKP 感染的高死亡率。本研究结果显示替加环素与多黏菌素体外联合有较大的协同作用，虽然这不能完全说明临床治疗使用时出现同样的效果，但可能为临床治疗CR-HvKP 感染提供新的治疗思路。