川崎病小鼠模型心功能演变过程研究

娄萍，焦富勇，张雪梅，张丹，赵颖，赵欣，王俊香，金晶，曹玲

川崎病（Kawasaki disease，KD）又称为小儿皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种以全身中小动脉炎症病变为主要特征的急性免疫系统疾病［1］，其病因不明。相关研究表明，KD可能与感染、遗传和超抗原因素有关［2-3］。KD好发于5岁以下儿童，其可导致患儿发生严重心血管病变，以冠状动脉损伤最为严重，包括冠状动脉扩张和冠状动脉瘤形成，最终导致患儿心肌缺血、心肌梗死等，目前其已取代风湿热而成为我国小儿后天性心脏病的主要病因之一［4］。本研究通过干酪乳杆菌细胞壁成分（lactobacillus casei cell wall extract，LCWE）诱导小鼠KD模型，并观察其心功能的演变过程，旨在探讨KD对心功能的影响。

1 材料和方法

1.1 LCWE制备 本实验时间为2020年1月。将干酪乳杆菌（贝纳细胞生物保存管理中心，第134415号）培养于乳酸菌肉汤培养基中24 h，在对数生长期收集细菌，添加4% SDS裂解，4 000 r/min离心30 min（离心半径8 cm），使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）反复冲洗，加入250 μg/ml RNase、DNase和胰蛋白酶，在37 ℃培养箱中培养4 h，使用PBS再次清洗后收集细菌碎片，并取1 g湿重加入5 ml PBS，冰浴，使用超声细胞破碎仪处理2 h（超声5 s、间隙5 s，功率300 W），将处理后的溶液离心1 h（4 ℃，15 600 r/min、离心半径8 cm），配置成LCWE的终液。

1.2 动物制备 随机选择50只BALB/c小鼠〔北京维顿利华实验动物技术有限公司,生产许可证SCXK（北京）2016-0006，销售许可证SYXK（陕西）2012-005〕，体质量（17.0±0.5）g,无特定病原体，将其分成模型组30只和对照组20只，并分别编写序号。模型组小鼠经腹腔注射LCWE的终液，单次注射0.5 ml；对照组小鼠不做任何处理。

1.3 方法 检测对照组及模型组小鼠建模后2 d、15 d、30 d心功能指标，具体如下：将小鼠胸口毛脱掉，放入密封盒中，吸入异氟烷将其麻醉，仰卧位固定在检查台上，同步记录小鼠心率。将超声探头固定在检查支架上，当小鼠心率稳定在400～500次/min时，胸口涂抹超声耦合剂，进行超声检查，通过调节检查支架的角度及探头方向而探查小鼠左心室长轴切面，采用M超记录左心室壁运动情况，同时记录左心室舒张 末 期 内 径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）和左心室收缩末期内径（left ventricular endsystolic diameter，LVESD），并计算左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），连续采集5个心动周期，并储存于后台，所用仪器为加拿大VISUALSONIC公司Vevo3100型高分辨率小动物超声心动图仪，选用Mx400单晶片机械扇扫宽频探头，固定聚焦深度为1.2 cm。

1.4 病理检查 对照组及造模后2 d、15 d、30 d模型组分别处死1只小鼠并取出心脏标本，立即置于体积分数为10%的甲醛溶液固定。常规脱水、透明、石蜡包埋、连续切片，苏木素-伊红（HE）染色及弹力纤维染色（EVG），使用光学电子显微镜（德国蔡司Zeiss Axio lab.A1）进行观察。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。计量资料先行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左心室壁运动情况 M超检查结果显示，对照组小鼠左心室壁运动幅度正常。造模后2 d，模型组6只（占20.0%）小鼠出现左心室壁运动幅度略减低，其中左心室前壁减低2只、左心室后壁减低4只；造模后15 d，模型组13只（占44.8%）小鼠出现左心室壁运动幅度明显减低，其中左心室壁普遍减低5只、左心室前壁减低3只、左心室后壁减低5只；造模后30 d，模型组8只（占28.6%）小鼠仍处于左心室壁运动幅度减低状态，其中左心室壁普遍减低4只、左心室前壁减低2只、左心室后壁减低2只，见图1。

图1 M超检查结果Figure 1 Test results of M- ultrasound

2.2 左心功能指标 造模后2 d模型组小鼠LVESD和LVFS低于对照组，差异有统计学意义（t值分别为2.149、2.097，P值均＜0.05）；造模后15 d模型组小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS低于对照组，差异有统计学意义（t值分别为4.167、2.434、2.930、3.716，P值均＜0.05）；造模后30 d模型组小鼠LVEDD、LVEF及LVFS低于对照组，差异有统计学意义（t值分别为3.604、2.986、3.184，P值均＜0.05），见表1。

表1 对照组与模型组小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS（±s）Table 1 LVEDD，LVESD，LVEF and LVFS of the control group and the model group

表1 对照组与模型组小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS（±s）Table 1 LVEDD，LVESD，LVEF and LVFS of the control group and the model group

注：与对照组比较，aP＜0.05；LVEDD=左心室舒张末期内径，LVESD=左心室收缩末期内径，LVEF=左心室射血分数，LVFS=左心室短轴缩短率

组别 只数 LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）对照组 20 4.32±0.67 3.10±0.37 54.11±9.18 26.27±4.78造模后2 d模型组 30 4.07±0.91 2.79±0.48a 49.44±10.39 22.44±6.09a造模后15 d模型组 29 3.53±0.44a 2.73±0.52a 42.27±14.46a 18.83±7.02a造模后30 d模型组 28 3.72±0.22a 2.96±0.31 43.05±12.74a 20.55±5.93a

2.3 病理检查结果 病理检查结果显示，造模后2 d，小鼠心脏组织结构正常，内膜及肌壁间局部可见中性粒细胞浸润，见图2A；造模后15 d，小鼠心外膜高度肿胀，可见大量中性粒细胞、少量单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，其内（左）冠状动脉管腔扩张及少量心肌细胞坏死崩解，见图2B；造模后30 d，小鼠左冠状动脉管壁增厚，弹力纤维不连续，心外膜血管扩张，间质水肿，可见淋巴细胞浸润及纤维结缔组织弥漫轻度增生，见图2C。

图2 模型组小鼠病理检查结果Figure 2 Pathological examination results of the model group

3 讨论

KD主要是T淋巴细胞亚群失衡后机体免疫系统异常活跃、内皮细胞受损，从而引发的血管炎症，其常累及人体的多个脏器。既往研究表明，72%～91%的KD会引起心脏病变［5］。KD最常累及冠状动脉，可引发冠状动脉扩张、冠状动脉瘤形成，严重者形成血栓，进而导致冠状动脉狭窄甚至闭塞［6］。1979年，LEHMAN利用LCME在小鼠身上成功诱导出动脉炎症，主要使中动脉、冠状动脉及大动脉根部受累，能很好地模拟冠状动脉损伤过程，是较成熟的动物实验模型［7］。

高频超声心动图可以直观、清晰地显示小鼠心脏结构，可动态观察心脏改变，且具有无创性［8］。M超可以记录小鼠心脏的运动幅度，测量左心室大小，并客观评价心功能变化［9］，是一种较理想的检查方式。但小鼠心功能指标的参考范围目前并未明确，故本实验将正常小鼠作为对照。

研究表明，通过观察心室壁节段性运动可较早评估冠状动脉缺血情况［10］。本研究结果显示，造模后2 d，模型组6只（占20.0%）小鼠出现左心室壁运动幅度略减低，对照组与造模后2 d模型组小鼠LVEDD和LVEF比较差异无统计学意义，提示KD急性期心脏受损程度可能还没有影响心功能，这与KD患儿急性期临床表现基本一致（疾病第1周内，患儿超声心动图通常是正常的［11］），也说明该阶段KD尚未侵犯到心脏。本研究结果显示，造模后15 d，模型组13只（占44.8%）小鼠出现左心室壁运动幅度明显减低，LVEDD、LVESD、LVEF和LVFS低于对照组，病理检查结果显示小鼠心外膜高度肿胀，可见大量中性粒细胞、少量单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，该阶段模型组小鼠心脏已符合KD心肌炎表现。KD患儿心肌炎表现主要是左心室收缩功能不全和心动过速，其中导致左心室收缩功能不全的主要原因是弥漫性心肌炎性损伤引起的心肌纤维化［12］，最终可使患儿发生充血性心力衰竭。既往研究表明，KD患儿心肌炎发生早、急性左心功能不全出现短暂［13］。本研究结果显示，造模后30 d，模型组8只（占28.6%）小鼠仍处于左心室壁运动幅度减低状态，LVEDD、LVEF及LVFS低于对照组。本研究结果还显示，KD模型小鼠异常的室壁运动节段主要出现在左心室前壁及后壁，而左心室前壁和后壁是左冠状动脉前降支及回旋支的供血区域［14］。冠状动脉炎管壁的炎性细胞浸润及内皮细胞肿胀，导致冠状动脉狭窄和心肌微灌注异常［15］，使心肌呈现出供血不足的表现。

综上所述，利用LCWE诱导KD小鼠模型，能够动态观察KD小鼠心功能演变过程，模拟KD对心脏功能的影响。但由于小鼠在测量过程中受到外力、环境及麻醉等影响，会使其心脏发生短暂的运动异常，即出现假阳性表现，因此实验过程中可以延长观察、记录时间或让小鼠短暂休息后再次测量，尽量避免假阳性结果及影响实验的准确性。

作者贡献：娄萍进行文章的构思与设计，并撰写论文；焦富勇进行研究的实施与可行性分析；娄萍、赵颖、赵欣、王俊香、曹玲进行数据收集、整理、分析；张丹、金晶进行结果分析与解释；张雪梅进行论文的修订；焦富勇、张雪梅负责文章的质量控制及审校；娄萍、张雪梅对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。