苯乙双胍通过激活AMPK抑制肝癌细胞增殖、集落形成及侵袭

(中南大学湘雅医学院附属株洲医院肿瘤科，湖南省株洲市412000)

肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一，居中国癌症发病率的第五位[1]，手术是其主要治疗手段，但大部分病人发现时已为肿瘤中晚期，丧失了手术机会。即使进行了手术切除、原位肝移植和射频消融术，由于肝癌的高侵袭性和复发率，其预后仍不理想[2]。近年来研究表明，二甲双胍除降糖作用外，还具有抗肿瘤作用[3]。苯乙双胍同为双胍类衍生化合物，结构上不同于二甲双胍[4]，抗肿瘤活性也不同于二甲双胍。苯乙双胍无需任何转运蛋白即可通过细胞膜[5]。因此，苯乙双胍比二甲双胍有更好的组织生物利用度，其抗肿瘤作用是二甲双胍的50倍[6]，且苯乙双胍具有直接抗肿瘤作用[7]，也可增强化疗、放疗[8]或者靶向治疗[9]的疗效。目前关于苯乙双胍在肝癌中作用的报道少见，本文就苯乙双胍对肝癌细胞增殖、集落形成、侵袭能力的影响，以及其分子机制进行研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

苯乙双胍(中国阿拉丁试剂公司)；p-AMPK兔抗人单克隆抗体(美国CST公司)；p-mTOR兔抗人单克隆抗体(美国CST公司)；β-actin兔抗人单克隆抗体(美国CST公司)；LipofectamineTM2000脂质体(上海碧云天生物科技公司)；siRNA-AMPK(广州锐博生物科技有限公司)；倒置荧光显微镜-DMI3000B(德国Leica公司)；全自动化学发光图像分析系统-4600(上海天能科技有限公司)；多功能酶标仪-Synergy HTX(美国BioTeK公司)；人肝癌细胞株Hep-G2由中南大学湘雅医院赠予；人肝癌细胞株SMMC-7721由湖南师范大学医学院赠予。

1.2 细胞培养

SMMC-7721、Hep-G2细胞培养在含10%胎牛血清和1%双抗的完全培养基中，培养箱控制在37 ℃、5% CO2、100%湿度的环境下，3～4天传代1次。由于苯乙双胍在两个细胞系的敏感度不同，故选择不同的浓度进行后续实验[10]。

1.3 细胞转染

由于Hep-G2对苯乙双胍更加敏感，因此选择Hep-G2进行转染实验。Veiga等[5]研究苯乙双胍作用于肝癌也同样选择的是Hep-G2细胞。取3×105个对数生长期的Hep-G2细胞接种在6孔板中，培养12 h后转染，利用脂质体2000将无义siRNA及AMPK siRNA转染细胞，依据转染siRNA不同分siAMPK组(转染AMPK siRNA)及siCtrl组(转染无义siRNA)，转染5 h后更换为完全培养基，siAMPK序列：5′-AATTACTTCTGGTGCAGCATAGCGG-3′,siCtrl序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 MTT细胞增殖实验

取8×103个对数生长期的SMMC-7721、Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2细胞接种在96孔板中，置于培养箱中24 h后，用不同浓度的苯乙双胍(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L处理SMCC-7721细胞，0、40、80、160、320、640 μmol/L处理Hep-G2细胞)处理72 h，然后吸出培养基，PBS轻柔清洗2遍，每孔中加入50 μL MTT溶液，继续培养5 h后向每个孔中添加150 μL二甲基亚砜，避光震荡15 min，酶标仪检测每孔在490 nm波长处的光密度(OD值)。细胞相对活力=实验组OD值/对照组OD值，使用Prism软件绘制MTT曲线。

1.5 克隆实验

取8×103个对数生长期的SMMC-7721、Hep-G2细胞接种在24孔板的每孔中，置于培养箱中24 h，用不同浓度的苯乙双胍(SMMC-7721细胞为0、10、20 μmol/L，Hep-G2细胞为0、25、50 μmol/L)处理5～7天，当对照组细胞(苯乙双胍浓度为0 μmol/L)生长至70%～80%时，取出24孔板，弃去完全培养液，用PBS轻柔清洗2遍，加10%福尔马林固定3 h，每孔加1 mL 0.1%结晶紫浸染1 h，浸染后用矿泉水缓慢轻柔清洗，倒置在纸上干燥，放入酶标仪中，选择波长为550 nm进行定量，使用Prism软件进行统计学分析。

1.6 侵袭实验

使用侵袭实验检测细胞侵袭能力[11]。取对数生长期的4×104个SMMC-7721细胞、8×104个Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2细胞分别混匀在无血清的培养基中，同时加入不同浓度的苯乙双胍(SMMC-7721细胞为0、100、200 μmol/L，Hep-G2细胞为0、50、100 μmol/L)，接种在小室上室，在24孔板下室加入500 μL完全培养液，常规培养24 h后，将小室上培养液丢弃，用10%多聚甲醛固定3 h，0.1%结晶紫染色5 h。用镊子将小室放在清水中轻轻洗涤，去除表面结晶紫，用棉签轻轻拭去上室的细胞。在显微镜下采集图片并计数细胞穿膜数。相对侵袭能力=实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数。

1.7 Western blot法

使用不同浓度苯乙双胍(0、100、200、400 μmol/L处理SMMC-7721细胞，0、50、100、200 μmol/L处理Hep-G2细胞)处理细胞24 h后收板。向每个孔中加200 μL蛋白裂解液裂解细胞，放置在100 ℃的水浴锅中加热10 min，取出备用。随后制胶、上样、电泳、转膜、剪膜、封闭，在4 ℃孵育一抗14～16 h，洗条带1 h，室温下孵育二抗1 h，使用TANON机器拍摄，用Image J软件分析目标条带的灰度值(蛋白相对表达水平=实验组灰度值/对照组灰度值)。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 转染效果鉴定及对AMPK表达影响

结果显示siCtrl组和siAMPK组AMPK蛋白相对表达量分别是0.94±0.08和0.15±0.07，siAMPK组细胞几乎无AMPK蛋白表达(P<0.05；图1)。成功转染Hep-G2细胞株。

图1 沉默AMPK后的AMPK蛋白表达

2.2 SMCC-7721和Hep-G2细胞增殖实验结果

与苯乙双胍浓度为0 μmol/L相比，SMMC-7721、Hep-G2细胞活力随苯乙双胍浓度增高而下降(图2)。与siAMPK组相比，siCtrl组对苯乙双胍的抑制作用更为敏感(P<0.05；图3)。

图2 细胞增殖实验结果a为P<0.05，与同细胞苯乙双胍0 μmol/L比较。

图3 沉默AMPK对Hep-G2细胞增殖的影响a为P<0.05，与siCtrl组比较。

2.3 SMCC-7721和Hep-G2细胞克隆实验结果

不同浓度的苯乙双胍处理Hep-G2和SMMC-7721细胞后，与苯乙双胍0 μmol/L组比较，苯乙双胍处理后细胞的集落形成能力明显下降(P<0.05；图4)。

图4 SMMC-7721和Hep-G2细胞克隆实验结果1、2、3、4、5、6分别为0、10、20、0、25、50 μmol/L的苯乙双胍组。a为P<0.05，与同细胞苯乙双胍0 μmol/L组比较。

2.4 SMCC-7721和Hep-G2细胞侵袭实验结果

与0 μmol/L组比较，苯乙双胍处理组细胞的侵袭能力明显下降，但相同浓度苯乙双胍(100 μmol/L)处理两个细胞系，Hep-G2侵袭能力下降更为明显(图5)。

图5 SMMC-7721和Hep-G2细胞侵袭实验结果(结晶紫染色，100×)1、2、3、4、5、6分别为0、100、200、0、50、100 μmol/L的苯乙双胍组，a为P<0.05，与同细胞苯乙双胍0 μmol/L组比较。

60 μmol/L苯乙双胍处理Hep-G2细胞以及沉默AMPK的Hep-G2细胞，如图6所示。苯乙双胍处理的siCtrl组与未予以苯乙双胍处理的siCtrl组相比，侵袭能力下降。苯乙双胍处理的siCtrl组与苯乙双胍处理的siAMPK组相比，siAMPK使Hep-G2细胞的侵袭能力较siCtrl组更强，沉默AMPK后，使苯乙双胍抗侵袭能力下降，但并非完全消失，而是使苯乙双胍抗侵袭能力减弱(P<0.05)。

图6 沉默AMPK对Hep-G2细胞侵袭的影响(结晶紫染色，100×)a为P<0.05，与siCtrl组比较。苯乙双胍浓度为60 μmol/L。

2.5 SMCC-7721和Hep-G2细胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表达情况

与0 μmol/L组比较，苯乙双胍处理后的肝癌细胞，p-AMPK表达量增加，p-mTOR表达量下降。苯乙双胍处理后蛋白表达水平与0 μmol/L组比较，差异具有统计学意义(P<0.05；图7)。

图7 SMMC-7721/Hep-G2细胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表达情况A为Western blot实验结果；B、C为蛋白表达柱状图。a为P<0.05，与同细胞苯乙双胍0 μmol/L组比较。

3 讨 论

肝癌是癌中之王，恶性程度十分高，发现时往往处于晚期，失去了手术的机会，放疗和化疗有效率偏低，预后极差，因此寻找治疗肝癌新药物至关重要。苯乙双胍作为降糖效果优于二甲双胍的双胍类降糖药，因其乳酸毒性而逐渐退出临床应用[12]。与二甲双胍相比，苯乙双胍具有更好的抗癌活性[13]。然而，迄今为止，很少有研究探讨苯乙双胍的抗肿瘤活性。苯乙双胍能抑制线粒体呼吸链复合物I[7]，降低三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成，一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ATP比率增高，最终诱导AMPK激活，进而抑制其下游信号通路蛋白mTOR[14]，抑制肝癌细胞的生长、增殖和侵袭[15]。AMPK作为一种细胞内能量传感器，负责调节代谢活动[16]。Appleyard等[17]研究表明，AMPK是双胍类药物作用的一个关键靶点，AMPK在肝脏中被激活。由此可知，苯乙双胍具有抗肿瘤活性，但很少有研究报道苯乙双胍与肝癌的关系。

本实验结果表明，苯乙双胍可以抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌细胞的活力、集落形成和侵袭能力，且随着苯乙双胍的浓度增大，肝癌细胞的活力、集落形成能力以及侵袭能力越低，其中可见Hep-G2细胞系较SMMC-7721细胞系对苯乙双胍更为敏感。肝癌的特点就是极易发生肝内转移，导致无法手术，治疗效果欠佳[18]，本实验使用侵袭实验检测肝癌细胞SMMC-7721和Hep-G2侵袭能力，发现苯乙双胍对两种细胞系的侵袭能力皆起到抑制作用，从而可能抑制肝癌的转移。AMPK和mTOR是肿瘤代谢中的重要靶点，Sabharwal等[19]发现苯乙双胍可诱导线粒体功能障碍和分裂，可使代谢向糖酵解转变，从而使肝癌细胞更容易受到mTOR抑制剂的影响，其研究得知苯乙双胍与mTOR抑制剂协同激活AMPK，增加ROS的生成和细胞死亡，从而共同抑制肝癌细胞的生长和增殖。本实验结果也表明苯乙双胍作用于SMMC-7721和Hep-G2肝癌细胞，可激活AMPK，并抑制其下游通路蛋白mTOR，从而发挥其抗肿瘤作用。为进一步探索是否通过AMPK发挥作用，选择对苯乙双胍更为敏感的Hep-G2细胞，进行AMPK沉默。结果表明，siAMPK组细胞增殖能力较siCtrl组明显增高，苯乙双胍作用于siAMPK组仍可以抑制细胞的增殖，但相较于siCtrl组抑制减弱。与MTT实验结果相似，侵袭实验也证实siAMPK组对苯乙双胍敏感度较siCtrl组降低，其迁移细胞数较siCtrl明显增多。由此，进一步证实苯乙双胍通过激活AMPK发挥作用，但沉默AMPK之后并不能完全抑制苯乙双胍抗肿瘤作用，表明苯乙双胍可能通过其他机制共同发挥抗肿瘤作用，例如通过作用于肿瘤干细胞[16,20]、抑制免疫[21]以及诱导细胞凋亡[22]等。除此之外，苯乙双胍还可以与各种靶向药物联合应用作用于肿瘤细胞[23-24]，增加靶向药物的作用，延缓靶向药物耐受时间，从而抑制肿瘤的生长、转移和进展。这可为肿瘤提供一种新的治疗方式。

综上所述，苯乙双胍抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌细胞的生长、增殖以及侵袭能力，其机制可能与激活AMPK，抑制mTOR有关。本实验结果为苯乙双胍未来应用于临床治疗肝癌提供理论基础，但未与临床化疗、放疗以及靶向药物联合，未来就其与药物协同作用的机制尚有待进一步研究，苯乙双胍有望成为肝癌治疗的一种新的药物。