二烯丙基二硫对CD44+人胃癌AGS细胞生长的影响

(南华大学衡阳医学院 1.肿瘤研究所，2.2018级临床医学系，湖南省衡阳市 421001)

胃癌是一种常见的全球性癌症[1]，人们一直在孜孜不倦地探寻其发病机理。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)假说认为,一群占比不高却具有干细胞特性的癌细胞驱动了肿瘤的发生发展，为癌症的深入阐明提供了新思路[2-6]。手术、放疗、化疗等传统的治疗策略以尽可能多清除癌细胞为目标，但肿瘤干细胞难以彻底杀死，导致癌症复发和转移，因此靶向消灭这类具有干细胞特性的胃癌细胞是胃癌治愈的切入点。

大蒜对肿瘤的有效杀灭作用主要依赖于其中所含的二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)，DADS的作用效果涉及对多种恶性生物学行为的抑制，是一种很有潜力的癌症治疗候选物[7-8]。本研究首先运用免疫磁珠分选技术从AGS胃癌细胞中分选富集CD44+细胞；接着经肿瘤球形成检测其干样特性、Transwell实验评估细胞迁移与侵袭效果；最后经DADS处理，通过MTT、软琼脂培养、流式仪等观察CD44+亚群的生长与周期分布情况，初步阐明DADS抑制人胃癌干样细胞生长的能力，以便进一步理解DADS对抗胃癌的治疗潜力。

1 材料和方法

1.1 材料

二烯丙基二硫(DADS)由Fluka公司生产，纯度80%。DMEM/F12培养基(1∶1)为赛默飞世生物化学制品(北京)有限公司出品。CD44包被磁珠购于Miltenyi Biotec公司。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)均为eBioscience公司产品。FITC标记的鼠抗人CD44抗体和FITC标记的鼠抗IgG2b同型对照抗体均购于Biolegend公司。B27培养基添加剂购于Invitrogen公司。Matrigel基质胶由美国BD公司生产，Transwell小室属于Corning产品。

1.2 细胞培养和分选

AGS细胞株来源于上海市中科院细胞库。采用磁激活细胞分选法(magneticallyactivated cell sorting，MACS)分选AGS细胞中CD44+亚群，为CD44+组；未分选细胞为AGS组。于含10%胎牛血清的DMEM培养基5%CO2、37 ℃恒温培养。

1.3 流式细胞仪检测CD44阳性率

首先用PBS洗涤未分选的AGS细胞和分选后的CD44+细胞，收集细胞，调整细胞为1×108个/L，加入FITC标记的CD44抗体，以锡箔纸包裹于4 ℃静置5 min。洗涤离心去除残液，2%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱存放24 h，流式仪(Beckerman coulter EPICS-XL)测细胞CD44阳性率。

1.4 肿瘤球形成能力实验

成球培养基(DMEM/F12 培养基+1 mg/L EGF+1 mg/L bFGF)分别将未分选的AGS细胞和分选后的CD44+细胞配成1×105个/L单细胞悬液，96孔板中以100 μL/孔铺板，取10个复孔。培育14天后，在倒置显微镜下查看成球状态，拍照，实验重复3次。

1.5 Transwell迁移及侵袭实验

使用无血清DMEM培养基将Matrigell胶制成5倍稀释液，混匀后在Transwell上室中加40 μL/孔并于37 ℃恒温培养箱中待其凝固。将凝好的Matrigell胶以无血清DMEM培养基润洗1次，其上种2.0×104个细胞备用。在24孔板中加入含血清(10%FBS)的DMEM培养基500 μL/孔后放入小室，37 ℃恒温培养箱内24 h。取出小室，以PBS清洗、棉球拭去上室残液、干燥、固定(4%多聚甲醛)、染色(结晶紫)。镜下观察、拍照并计数统计，实验重复3次。迁移实验不用Matrigell胶，其余步骤同上。

1.6 MTT实验

取对数生长细胞，接种至96孔板，加入不同质量浓度(20、30、40、50、60 mg/L)DADS，每组6个复孔，设不加DADS的为对照组，置5%CO2、37 ℃细胞培养箱中48 h。每孔加20 μL MTT溶液,培养4 h后弃上清液,加150 μL/孔二甲基亚砜，摇匀。10 min后置酶标仪测定OD490。重复3次。抑制率(%)=(1-ODCD44+组/ODAGS组)×100%。

1.7 软琼脂集落形成实验

6孔板中铺底层琼脂凝胶(3%琼脂与含10%FBS DMEM培养基以1∶5混匀)1.5 mL/孔备用。收集CD44+细胞，不加DADS的为对照组；加入不同质量浓度(30、60 mg/L)DADS的为DADS组。将各组细胞制成1×108个/L单细胞悬液；铺上层胶(3%琼脂与含10%FBS DMEM培养基以1∶9配置，加入100 μL细胞悬液吹匀)1 mL/孔。37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养14天后，倒置显微镜下拍照，统计细胞成团数。实验重复3次。

1.8 流式细胞术分析细胞周期

CD44+细胞接种于两块6孔板，DADS组加入不同质量浓度(30、60 mg/L)DADS；不加DADS的为对照组。PBS、75%乙醇预冷备用。分别于DADS处理24 h、48 h后取出相应孔板收集各组细胞。75%乙醇充分悬浮细胞进行固定；离心去除残液，加50 μL RNA酶裂解30 min；加50 μL碘化丙啶(PI)混匀静置30 min(此过程需避光)；用流式细胞仪计数1×104个细胞，分析细胞周期分布。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 AGS细胞中分选CD44+细胞

胃癌细胞中CD44+细胞比例为2.8%，MACS分选后的CD44+比例为99.9%，表明MACS技术从AGS细胞中富集了纯度高的CD44+干样细胞(图1)。

图1 流式细胞仪检测两组CD44+表达结果

2.2 CD44+细胞肿瘤球形成能力的比较

分选前后的胃癌细胞均接种于无血清培养基。CD44+细胞培养2周后可见典型的肿瘤球形成，同期未经分选的AGS细胞发生部分细胞崩解死亡，未见明显肿瘤球形成(图2)。以上结果提示CD44+细胞增殖能力明显增强。

图2 AGS细胞分选前后肿瘤球形成情况的比较(100×)

2.3 CD44+细胞迁移能力的比较

与未分选的AGS细胞比较，分选后的CD44+细胞穿过微孔膜的细胞量明显增多(P<0.05；图3)，说明CD44+干样细胞的迁移能力明显增强。

图3 两组细胞迁移能力的比较(结晶紫染色，100×)a为P<0.05，与AGS组比较。

2.4 CD44+细胞侵袭能力的比较

相较于未分选的AGS组，侵入微孔膜下层的CD44+干样细胞数明显增多(P<0.05；图4)，CD44+干样细胞表现出更强的侵袭性。

图4 两组细胞侵袭能力的比较(结晶紫染色，100×)a为P<0.05，与AGS组比较。

2.5 DADS对CD44+干样细胞增殖的影响

MTT结果显示，不同质量浓度(20、30、40、50、60 mg/L)DADS处理48 h后，CD44+细胞OD490比对照组低，且随着质量浓度增加OD490逐渐降低，抑制率明显上升(P<0.05；表1)。

表1 不同质量浓度DADS对CD44+干样细胞增殖的影响

2.6 DADS对CD44+干样细胞集落形成能力的影响

与对照组比较，30 mg/L和60 mg/L DADS处理后集落形成数明显减少(P<0.05；表2)。在集落形态上，对照组集落大，集落数多，而30 mg/L和60 mg/L DADS处理后可见集落直径明显变小，集落数目减少(图5)。以上说明，DADS对CD44+细胞增殖具有明显抑制作用。

表2 不同质量浓度DADS对CD44+干样细胞集落形成的影响

图5 DADS对CD44+干样细胞集落形成能力的影响(40×)

2.7 DADS对CD44+干样细胞周期分布的影响

流式细胞术分析发现(图6和表3)，DADS(30 mg/L和60 mg/L)分别加入CD44+细胞24 h和48 h后，细胞周期分布G2/M期百分比显著高于对照组(P<0.05)，且同时段60 mg/L组高于30 mg/L组，同质量浓度处理48 h组高于24 h组，表明DADS处理可导致CD44+细胞发生G2/M期阻滞。

表3 不同质量浓度DADS对CD44+细胞周期的影响 单位：%

图6 DADS对CD44+细胞周期分布的影响

3 讨 论

“肿瘤干细胞学说”为恶性肿瘤的防治研究提供了新策略。上个世纪90年代有研究者首次分离出具有干细胞特点的CD34+/CD38-白血病细胞[9]，后续包括胃癌在内的实体瘤中也找到了具有干细胞特性的细胞亚群[2-6,10]。据报道，CD44在多种胃癌细胞中可作为干样细胞的分选标志物[6]。

本研究发现，人胃癌AGS细胞中CD44+细胞占比2.8%。说明CD44+细胞是AGS细胞中含量较少的一个亚群，CD44包被磁珠进行免疫磁珠分选后CD44+细胞百分比提高至99.9%，提示免疫磁珠分选纯化后富集到了CD44+的胃癌干样细胞。为了证实CD44+细胞的干样特性，本研究采用了肿瘤球形成、Transwell迁移及侵袭实验进行验证。

细胞成球实验中，人胃癌AGS细胞生长缓慢，不形成肿瘤球，而分选富集的CD44+细胞持续增殖，在无血清培养条件下具有典型的球形集落，提示CD44+细胞具有很强的自我更新能力。

CD44是细胞表面一种重要的黏附分子，可参与细胞的增殖、迁移和侵袭能力调节，在恶性肿瘤进展和侵袭转移中起关键作用。研究发现来源于人胃癌SGC7901细胞的胃癌干细胞迁移侵袭能力明显增强[11]。本研究自人胃癌AGS细胞分选出的CD44+细胞也展现出了更强的迁移、侵袭能力。由此可见，人胃癌细胞CD44的表达有助于促进人胃癌细胞的恶性表型，赋予其“干样”特性。

本研究前期结果已经证实DADS可抑制人胃癌细胞恶性表型，但其对人胃癌干样细胞的作用不明确，因此本研究对此进行了探讨。结果发现，人胃癌细胞AGS在不同质量浓度DADS处理48 h后，其光密度比对照组显著下降，而抑制率明显升高，具有质量浓度依赖性。此外，30、60 mg/L DADS均可对CD44+细胞的集落形成能力产生显著抑制效应，且60 mg/L组高于30 mg/L组；与对照组比较，DADS组集落较小，且集落数目也减少。最后，本研究通过流式细胞仪分析表明，经DADS处理的细胞具有G2/M期阻滞效应。综上所述，DADS对胃癌干细胞具有明显生长抑制作用。

胃癌干细胞的来源之谜还未被彻底揭晓，有研究显示，胃肠道上皮组织处于快速自我更新状态，高分化的组织特异细胞很难发生基因突变，而干细胞维持长久的活力更易产生基因突变，因此胃成体干细胞发生基因突变可能是导致恶变的关键[12]。

本研究经免疫磁珠分选富集的CD44+细胞显示出干细胞特性，这些细胞可能驱动胃癌的发生发展。下一步需要阐明DADS作用于胃癌干细胞的作用机制，为开发靶向胃癌干细胞提供治疗策略，为DADS成为胃癌治疗候选药物提供实验依据。