P53和多粘连细胞外基质蛋白LAMC2在食管鳞癌中的表达相关性研究*

鲁陈陈，常 晨，刘东播，郝佳洁，王明荣

(1.蚌埠医学院人体解剖学教研室，安徽 蚌埠 233030;2.中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室)

食管癌是世界十大恶性肿瘤之一，在中国最常见的肿瘤中排名第五位，致死率排名第四位[1]。食管鳞癌的高死亡率主要原因为发现较晚，手术治疗5年生存率仍然不超过40 %[2]。因此，提高食管癌治疗水平已经成为医学界的研究热点。近来，大规模基因组研究发现食管鳞癌基因组存在多种突变，其中包括TP53、PIK3CA和ZNF750等[3-6]，且许多突变存在明显的瘤内异质性[7]。本课题组前期研究也发现LAMC2蛋白在食管鳞癌中存在高表达和异质性[8]。LAMC2(Laminin 5γ2 chain,LN-5γ2)是一种多粘连细胞外基质蛋白，由一个重链α链(400 KD)和两个轻链β、γ链(130～200 KD)组成的十字形异源三聚体。LAMC2在肿瘤细胞分化、迁移和增殖中起重要作用，而且有可能作为肿瘤潜在的标志物。在本研究中，我们进一步扩大样本检测LAMC2蛋白的表达，并且利用相同病例的连续切片检测P53蛋白的表达，探讨两个分子之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料 2011至2012年间河南林州肿瘤医院病理科收取的食管癌手术组织150例，均经过病理学诊断为食管癌鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)。组织标本来源患者中女性38例，男性112例；年龄34～78岁，中位年龄61岁；肿瘤分期pT1、pT2、pT3期分别为5、23、122例；有、无淋巴结转移分别为89、61例；肿瘤高、中、低分化病例数分别为20、82、48例。所有标本均为病理诊断后剩余的标本，本研究的设计和开展获得了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准(16-084/1163)。

1.2方法

1.2.1组织微阵列制备 将收取的组织标本进行常规石蜡包埋、切片和HE染色，经过显微镜阅片。每例针对包含上皮全层的手术切缘组织(正常食管组织)镜下选取2个点，肿瘤组织取3个点。将相应组织点在蜡块上标记，利用穿刺针将供体蜡块转移至受体蜡块，制作成组织微阵列。每个组织微阵列包含20个病例，每个病例5个点分别为N-1、N-2、T-1、T-2、T-3，切片厚度为5 μm。

1.2.2免疫组织化学染色 两张连续的组织微阵列切片同时经68 ℃烤箱烤片120 min，烘烤完毕立即放入二甲苯脱蜡，然后经100 %、85 %、75 %梯度乙醇各5 min水化，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min洗涤。经3 %双氧水封闭内源性过氧化物酶15 min，0.1 %枸橼酸钠缓冲液修复20 min。两张组织微阵列切片分别滴加一抗Anti-LAMC2(美国 Chemicon公司)和Anti-TP53(北京中杉金桥生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜(>8 h)。次日经磷酸盐缓冲液PBS浸泡冲洗后，依次滴加PV9000免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)中的聚合物辅助剂和酶标山羊抗鼠/兔IgG 聚合物，在37 ℃温箱分别孵育20 min和30 min。二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色，苏木素复染，梯度乙醇各5 min脱水，二甲苯浸泡透明，中性胶封片后镜下检查。

1.3免疫组织化学结果判断 以细胞浆(LAMC2)或细胞核(P53)出现棕褐色颗粒为阳性表达信号，对阳性细胞浆和细胞核染色强度和所占百分比进行评分。染色强度评价方法：无棕褐色为0分，浅棕褐色为1分，中度着色为2分，深棕褐色为3分。按阳性细胞浆和细胞核的细胞所占百分比评分：阳性细胞百分比≤10 %为1分，11 %～30 %为2分，31 %～50 %为3分，≥51 %为4分。根据染色强度和阳性细胞百分比评分之和进行总体评分。每例肿瘤3个位点分别进行评分，取3个肿瘤位点的平均分为终评分。根据最终评分，将0-1分定义为阴性，2-3分为阳性。

1.4统计学方法 使用SPSS Statistics 23.0软件进行数据统计学分析，采用卡方检验判断LAMC2和P53的蛋白表达改变与临床病理参数(患者性别、年龄、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移及肿瘤分期)的相关性、以及P53和多粘连细胞外基质蛋白LAMC2在食管鳞癌中的表达相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1LAMC2在食管鳞癌组织中的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，LAMC2蛋白在正常食管上皮组织中全为阴性，在食管鳞癌组织中的阳性率为43.3 %(65/150)，两者比较差异有统计学意义(χ2=82.979，P<0.001)，见表1。LAMC2蛋白在食管鳞癌中表达定位于细胞质和细胞膜，在肿瘤边缘区域表达较强，而在肿瘤中部表达较弱或为阴性(图1)。

图1 食管鳞癌组织中LAMC2的表达情况

表1 食管鳞癌组织中LAMC2的表达情况[(n) %]

进一步分析与临床病例参数的关系，结果表明LAMC2表达与患者性别、T分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移均相关，女性患者的LAMC2表达率高于男性患者(P<0.05),T3期患者LAMC2表达率高于T1-2(P<0.05),N1期患者LAMC2表达率高于N0期(P<0.05),G3期患者LAMC2表达率高于G1-2(P<0.05)，见表2。

表2 LAMC2蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系[(n) %]

2.2P53在食管鳞癌组织中的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，P53蛋白在食管鳞癌的手术切缘正常食管上皮组织中也全为阴性，在食管鳞癌组织中表达于细胞核，阳性率为59.3 %(89/150)，两者比较差异有统计学意义(χ2=126.54，P<0.001)，见表3，图2。

图2 食管鳞癌组织中P53的表达情况

表3 食管鳞癌组织中P53的表达情况[(n) %]

进一步分析与临床病例参数的关系，结果表明P53表达与患者性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移均相关，女性患者的P53表达率低于男性患者(P<0.05)，N1期患者P53表达率低于N0期(P<0.05),G3期患者P53表达率高于G1-2(P<0.05)，见表4。

2.3LAMC2和P53在食管鳞癌组织中的表达具有相关性 综合分析两种蛋白在食管鳞癌中的表达情况，两种蛋白双阳性率为32.7 %(49/150)，均不表达者占30 %(45/150)。经卡方检验差异具有统计学意义(χ2=12.248，P<0.001)，见表5，图3。

表4 P53蛋白与食管鳞癌患者临床病理特征的关系[(n) %]

图3 食管鳞癌组织连续切片中LAMC2和P53表达正相关

上排为LAMC2蛋白下排为P53蛋白在肿瘤组织表达(SP×200)：(1)A1-2：LAMC2和P53均不表达；(2)B1-2：LAMC2和P53均中度表达；(3)C1-2：LAMC2 和P53均高表达。

表5 LAMC2和P53在食管鳞癌组织中的表达相关性

3 讨论

本课题组在前期研究中，以河南地区的食管鳞癌组织标本，检测LAMC2的表达，结果表明LAMC2在正常组织中不表达，在肿瘤组织中的阳性率为40 %，LAMC2的阳性表达与患者的肿瘤分化程度有关[8]。在此基础上，进一步扩大病例，检测安徽地区食管鳞癌组织中的LAMC2的表达，与前期结果类似，LAMC2在正常组织中不表达，在肿瘤组织中的阳性率为43.3 %。但在本次研究中，LAMC2的表达与患者的性别、T分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移均相关，这种地区的差异可能与河南地区和安徽地区的饮食结构有关，但是具体原因有待进一步研究明确。

此外，本研究特别使用连续切片同时检测了P53的表达。TP53作为目前被发现的最重要的抑癌基因之一，当TP53发生突变时，不仅使其正常功能缺失，还会导致下游基因表达失调，进而引起肿瘤[9]。TP53突变在蛋白水平的最突出表现是其半衰期延长，即在正常细胞中P53蛋白的半衰期很短，常规的免疫组织化学染色检测不到；而在许多肿瘤中，TP53发生突变后，正常的蛋白降解途径发生变化，导致P53蛋白不能正常降解，故其半衰期延长而异常积累[10]。利用免疫组织化学技术检测P53蛋白可观察到明显的肿瘤细胞核染色信号[11]。因此在本研究中，通过免疫组织化学染色技术去探索P53在食管鳞癌中的表达，结果发现P53在正常食管上皮组织中不表达，而在食管鳞癌肿瘤组织中有59.3 %的表达。

本研究中发现P53蛋白的表达和LAMC2表达正相关，P53蛋白在核内具有激活基因转录的作用[12]，推测食管鳞癌中P53可能通过某种方式促进LAMC2的表达。Amelio等在胆管癌中通过大规模基因测序发现LAMC2表达与P53的表达存在正相关，并认为这一相关性可能是通过EGFR通路调控，TP53突变型R273H可能通过HIF1A通路调控LAMC2的表达[13]。此外，高表达的LAMC2通过EMT和EGFR通路促进肿瘤转移[14]。本次研究也发现LAMC2高表达与淋巴结转移有关。因此，这种P53蛋白的异常积累和LAMC2的高表达可能共同作用导致肿瘤转移。但是TP53在食管鳞癌中通过何种机制影响LAMC2的表达，还有待在进一步的研究中深入探索。

综上所述，本次研究发现在食管鳞癌中P53和LAMC2存在较高频率的表达增强，而在正常食管上皮组织中不表达。而且，两者的表达存在正相关，可能综合作为食管鳞癌的候选标志物。