卡托普利对肝纤维化大鼠肝功能及肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原的影响*

王晓露，张 坤，曾庆鑫，胡 海，孙 洁

(1.内蒙古科技大学包头医学院2017级研究生，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院病理生理学教研室；3.内蒙古包钢医院)

肝纤维化是肝组织在多种损伤因素作用下发生细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的慢性增生，随着时间的推移，逐渐形成慢性肝损伤[1]，如果任其发展，可导致肝功能衰竭、门静脉高压征和肝癌等。肝纤维化发生机制包括激活的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)产生ECM、氧化损伤和凋亡、炎症等。静止的HSC在受到大量生长因子和缺氧产生的促炎性介质刺激后，将转变为成纤维细胞，成纤维细胞能够产生大量Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)等ECM成分[2]。因此，抑制HSC的激活和collagen Ⅰ的合成是治疗肝纤维化的方向之一。

已有文献报道，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)能够激活HSC并增加转化生长因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)所有亚型的mRNA表达水平，提示抑制Ang Ⅱ的合成可能成为治疗肝纤维化的一个研究切入点[3]。作为血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)的药物卡托普利，具有抑制Ang Ⅱ合成的作用，但是其能否通过抑制HSC的活化，进而改善肝功能，目前还未见报道。

本研究对肝纤维化大鼠进行卡托普利治疗，旨在探讨卡托普利在肝纤维化的治疗中的作用及其机制，为临床上肝纤维化的治疗提供新思路。

1 对象与方法

1.1实验动物 5～6周龄SPF级SD雄性大鼠40只，体重180～220 g，由北京市斯贝福生物技术有限公司提供[SCXK(京)2016-0002]。

1.2主要试剂 四氯化碳(CCl4)购自上海柏榕生物科技有限公司，橄榄油购自北京中企华业食品有限公司，兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)检测试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司，卡托普利购自上海华源安徽仁济制药有限公司。

1.3方法

1.3.1动物分组、肝纤维化模型复制及给药方法 采用皮下注射CCl4法复制肝纤维化动物模型：将40只SD大鼠随机分为5组，分别为对照组、模型组、卡托普利(ACEI)高、中、低剂量组，每组8只。所有大鼠可自由饮水，同时给予标准饲料喂养。除对照组外，其余各组大鼠皮下注射以橄榄油稀释的10%CCl4(5 mL/kg)，对照组大鼠注射等体积的橄榄油，每周2次，共20周；从注射造模第5周开始，ACEI组分别每日给予卡托普利(20 mg/kg、15 mg/kg和10 mg/kg)灌胃治疗，同时对照组与模型组给予等量生理盐水直至造模结束。

1.3.2标本获取及保存 (1)血清标本采集：造模结束后大鼠禁食不禁水8 h，称重，麻醉后开腹，于腹主动脉取血8～10 mL，静置2 h后离心(4 000rpm，4℃)15 min后取上清液，分装后于-80 ℃冰箱冻存。(2)肝组织标本收集：完整切离肝脏，分别于各肝叶处取1块肝脏(厚约4mm)，于4 %多聚甲醛固定液中固定至少24 h、常规脱水、石蜡包埋，将剩余肝脏组织切块，分装于冻存管中，于-80 ℃冰箱冻存。(3)肝组织RNA提取：采用Trizol法提取RNA，反转录为cDNA，于-80 ℃冰箱冻存。

1.3.3RT-PCR 使用TRIzol法提取肝组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计测定RNA的质量和浓度，A260/A280为1.18～2.10。使用RT-PCR两步法试剂盒将RNA逆转录成cDNA后进行扩增反应。将PCR反应产物分别在2 %琼脂糖凝胶上电泳，用Tanon1600凝胶成像系统对DNA条带进行吸光度扫描，与相应GAPDH吸光度的比值为Collagen Ⅰ和α-SMA的相对表达水平。实验重复3次以上，取均值。PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4免疫组化分析 取肝组织石蜡切片，采用SP法免疫组织化学染色检测Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表达，DAB显色后，镜下观察，视野中呈棕黄色的细胞为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野拍照，应用图像分析软件Image-Pro-Plus6.0测定目的蛋白的平均光密度值[积分光密度(IOD SUM)/组织面积(Area SUM)]，检测目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1各组大鼠肝功能比较

2.1.1血清谷丙转氨酶水平比较 对照组、模型组与ACEI各治疗组5组间比较，差异有统计学意义(F=20.014，P=0.000)；进一步进行两组间比较，与对照组比较，模型组血清ALT表达水平升高(P=0.000)，与模型组比较，ACEI高、中、低剂量组血清ALT表达水平降低(P均为0.000)。

2.1.2血清谷草转氨酶水平比较 对照组、模型组与ACEI治疗组5组间比较，差异有统计学意义(F=47.825，P=0.000)；进一步进行两组间比较，与对照组比较，模型组血清AST表达水平升高(P=0.000)，与模型组比较，ACEI治疗高剂量组血清AST表达降低(P=0.000),见图1。

图1 各组大鼠肝功能比较

2.2各组大鼠肝组织Collagen I表达水平比较

2.2.1大鼠肝组织Collagen I mRNA的表达情况 RT-PCR结果显示，对照组、模型组与ACEI各治疗组5组间比较，差异有统计学意义(F=16.687，P=0.000)；与对照组比较，模型组大鼠肝组织Collagen I mRNA 表达水平升高(P=0.000)，与模型组比较，ACEI高、中、低剂量组 Collagen I mRNA水平均降低(P均为0.000),见图2。

2.2.2大鼠肝组织Collagen I蛋白的表达情况 免疫组化切片结果中，棕黄色染色颗粒为阳性，主要着色部位在细胞间隙。在对照组大鼠肝组织中，仅在中央静脉及汇管区周围可见极少量Collagen I沉积，而模型组肝组织有Collagen I大量表达，尤其在中央静脉及汇管区周围、纤维间隔周围，在ACEI治疗组，Collagen I的表达集中在中央静脉及汇管区周围。对照组、模型组与ACEI治疗组5组间比较，差异有统计学意义(F=491.464，P=0.000)；进一步进行两组间比较，与对照组相比，模型组Collagen-Ⅰ表达量增加(P=0.000)，与模型组相比，ACEI各治疗组Collagen Ⅰ表达量均减少(P均为0.000),见图3。

图2 大鼠肝组织 Collagen I mRNA水平比较

图3 大鼠肝组织 Collagen Ⅰ蛋白水平比较(×200)

2.3各组大鼠肝组织α-SMA表达水平比较

2.3.1大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达情况 RT-PCR结果显示，对照组、模型组与ACEI各治疗组5组间α-SMA mRNA表达比较，差异有统计学意义(F=142.234，P=0.000)；与对照组比较，模型组大鼠肝组织α-SMA mRNA表达水平升高(P=0.000)；与模型组比较，ACEI高、中、低剂量组α-SMA mRNA水平均降低(P均为0.000),见图4。

图4 大鼠肝组织α-SMA mRNA水平比较

2.3.2大鼠肝组织α-SMA蛋白的表达情况 免疫组化切片中，棕黄色染色颗粒为阳性，主要着色部位在细胞间隙。在对照组大鼠肝组织中，仅在中央静脉壁和汇管区动、静脉壁有少量表达，与对照组相比，模型组α-SMA大量表达，尤其在纤维增生的汇管区，中央静脉及汇管区周围、纤维间隔周围，在ACEI治疗组中，α-SMA的表达集中在中央静脉及汇管区周围，纤维间隔伴有少量增生。对照组、模型组与ACEI治疗组五组间比较，差异有统计学意义(F=107.382，P=0.000)；进一步进行两组间比较，与对照组比较，模型组α-SMA的表达量增多(P=0.000)，与模型组相比，ACEI高、中、低剂量组α-SMA表达量减少(P均为0.000),见图5。

图5 大鼠肝组织α-SMA蛋白水平比较

3 讨论

越来越多的证据表明，肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)与HSC活化、肝纤维化的发生发展密切相关。Ang Ⅱ作为RAS的效应分子，可以诱导炎症反应和激活HSC，促进肝纤维化的发生、发展[4]。然而，拮抗RAS的作用，是否对肝纤维化有治疗作用，仍需进一步研究。因此，本实验采用RAS拮抗剂(ACEI类药物)卡托普利进行治疗，旨在探讨RAS与肝纤维化的相关性，为临床上肝纤维化的治疗提供新的思路。

ALT主要分布于肝细胞胞浆，AST主要分布于肝细胞线粒体，少数分布于胞浆。由于肝细胞和血液中转氨酶水平相差较大，肝细胞内转氨酶的表达水平约为血液中的100倍，因此，临床上通常用这两种指标来反应肝细胞的损伤程度[5]。本研究结果中，模型组大鼠血清AST和ALT的表达量均升高，提示肝纤维化大鼠肝功能受损，而卡托普利治疗后有下调AST和ALT的作用，结果表明卡托普利对肝纤维化大鼠肝功能具有保护作用。

研究表明，在除去肝损伤因素后，肝纤维化是可以逆转的[6]。然而，反复肝损伤会导致肝细胞再生失败，并且肝细胞会被异源细胞(如胶原)替代。在慢性肝纤维化中，Collagen I含量明显增多，从而导致肝组织发生结构、功能紊乱[7]。因此，Collagen I的增生也可以作为判断肝纤维化发生的指标之一。本结果中，模型组大鼠肝组织Collagen I mRNA和蛋白表达量均增多，说明本实验肝纤维化动物模型复制成功，而应用卡托普利治疗后，Collagen I的mRNA和蛋白表达量减少，说明卡托普利在一定程度上能够缓解肝纤维化程度。

α-SMA通常表达于血管平滑肌细胞中，具有收缩性，有助于血管运动和收缩。在正常肝脏中，HSC呈静止状态，而肝损伤后，HSC受到多种因素刺激的作用而表现为活化状态，合成并分泌α-SMA等细胞因子增多。因此，α-SMA可作为HSC激活的标志分子，在一定程度上反映HSC的激活程度[8]。本研究发现，模型组大鼠肝组织α-SMA mRNA和蛋白水平均有升高，而ACEI治疗后α-SMA mRNA和蛋白水平有所降低，提示模型组大鼠体内有HSC的激活，而卡托普利治疗能够下调HSC的激活程度。因此，卡托普利缓解肝纤维化的机制与其抑制HSC的激活、干预α-SMA的表达有关。

综上所述，本研究结果提示，ACEI类药物卡托普利作为RAS的拮抗剂，可以保护肝纤维化大鼠的肝功能，缓解其肝纤维化程度，该作用与其抑制HSC的激活并下调肝组织Collagen I和α-SMA的表达水平有关。