纹党和红芪加工废弃物中活性多糖对衰老小鼠学习记忆能力和抗疲劳作用的影响

叶文斌，杨文，陈耀年，宫峥嵘，何玉鹏

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃 成县 742500)

近年来国家将中医药发展作为经济社会发展的重要战略举措，引导大量资金向中药农业输入，鼓励中药企业将药材加工等工业前处理环节向中药材产区转移，延伸中药材产业链.甘肃省依据国家的指导方针，大力实施陇药振兴计划，明确支持建立中药材生产基地，甘肃道地中药材纹党[Codonopisispilosula(Franch.)Nannf.]和红芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)是主要支持和推广种植的中药材，而陇南市文县和武都区是这两种药材的道地产区，也是中国国家地理标志产品[1-3].近几年陇南市纹党和红芪年产量超过600万t，已成为中国最大的纹党和红芪的生产、加工和销售基地[1].随着纹党和红芪2种中药材种植和加工规模的扩大，在采收和加工过程中会产生头、须、根、渣、皮等数量巨大的加工废弃物，这些废弃物的资源化再利用没有得到较好的解决，而是大量堆放，最后作为肥料流入大田，这样不但会对农作物产生不良影响，污染农田和环境，而且这些废弃物中含有的生物活性成分也严重浪费了.为了减少资源的浪费，提高废弃物资源化再利用，本文以纹党和红芪加工废弃物提取的多糖为研究材料，通过颈部皮下注射D-半乳糖构建的小鼠亚急性衰老模型，用2种多糖对衰老小鼠的学习记忆能力和抗疲劳作用进行研究，对衰老模型动物进行评价，评估两种多糖的抗衰老和抗疲劳功效，以期为纹党和红芪加工废弃物的综合开发和利用提供技术参考.

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF KM小鼠，雄性，体质量22～28 g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，许可证号：SCXK(甘)2015-0001.小鼠饲养于鼠笼内，饲养环境温度为 22～25 ℃，湿度为35%～50%.

1.2 主要材料与仪器

纹党与红芪加工废弃物多糖由陇南师范高等专科学校农林技术学院固体废弃物实验室提供，纹党多糖和红芪多糖占废弃物总成分质量分数分别为16.52%和13.96%，纯度分别为99.65%和99.38%[1].D-半乳糖购自上海禾丰制药有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；HH-6数显恒温水浴锅，上海千载科技有限公司；TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；UV759紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；全自动生化分析仪AU5800，贝克曼库尔特有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 亚急性衰老小鼠模型的建立 用0.9%生理盐水配制5%的D-半乳糖(D-galactose)溶液，备用.取80只适应性喂养7 d的小鼠，随机取10只小鼠饲喂基础鼠饲料作为CK(0)组，将其余70只小鼠按照体质量0.5 mL/10g的剂量标准颈部皮下注射5% D-半乳糖，42 d后，测定各组小鼠体质量和血清中SOD、CAT活性及MDA含量.如与对照组相比有显著性差异，则视为亚急性衰老小鼠造模成功[14-15].

1.3.2 小鼠衰老试验中纹党多糖和红芪多糖浓度的筛选 取建模成功的小鼠60只，适应性饲养一周后，将60只随机分为两大组，建立纹党多糖和红芪多糖试验组，每一大组分为6小组，每一小组5只.按50、100、200、400、600 mg/kg标准每天分别灌胃纹党多糖(CPP)和红芪多糖(CHP)一次；另取建模成功的小鼠10只，5只喂食与多糖等量的生理盐水为对照组(CK0)，剩余5只备用.筛选最佳纹党多糖和红芪多糖的使用剂量便于后续试验.在试验期间，保证小鼠自由饮食和活动，灌胃纹党多糖和红芪多糖14 d后，测定各组小鼠血清中SOD、CAT活性及MDA含量，小鼠采血前禁食12 h后，断尾采血1.0 mL在4 000 r/min离心15 min分离出血清，测定指标的所有操作均按试剂盒说明书进行.

1.3.3 小鼠学习记忆能力的测定 迷宫长宽各为150 cm，高75 cm，迷宫路径宽35 cm，迷宫均有4个分区，只有一个入口和一个出口，迷宫上方有一摄像机对试验小鼠活动进行全程跟踪摄录.将建模成功的小鼠用筛选出来的纹党多糖和红芪多糖以400 mg/kg剂量标准每天灌胃一次，按170 mg/kg剂量每天灌胃一次VE为阳性对照组(VE组)，喂食与VE等量的生理盐水为对照组(CK0)；在试验期间，保证小鼠自由饮食和活动，连续灌胃纹党多糖和红芪多糖第 4周后进行学习记忆能力测试，试验前禁食不禁水24 h，在出口放置鼠粮，放入小鼠后迅速关闭入口，用小鼠找到鼠粮所需的时间表示小鼠的学习记忆能力.每日将小鼠放入入口，试验过程鼠粮位置保持不变，详细记录小鼠从入口到达鼠粮放置的出口所需时间作为学习和记忆成绩，若在设定时间内小鼠未找到出口，则停止跟踪计时，休息10 min后再次开始训练.试验在隔音安静的房间内进行[14-15].

1.3.4 小鼠游泳时间和爬杆时间的测定 小鼠游泳试验设置的水温为28 ℃，所有小鼠游泳箱内的水深控制在 35 cm左右，迫使其不停游泳.记录小鼠从入水至全部身体沉入水中的时间，作为小鼠游泳的时间.在整个试验过程中保持安静，以免小鼠受到惊吓，将模型小鼠和对照小鼠放置在长30 cm的玻璃棒上，玻璃棒的直径控制在10 mm左右，要使小鼠身体各部位肌肉保持紧张感觉，记录小鼠从入杆至全部身体滑下之间的时间，作为小鼠爬杆的时间[15-16].

1.3.5 小鼠常压耐缺氧时间的测定 将所有小鼠依次放置在放有100 g石灰的干燥瓶中，当小鼠进入大瓶后及时密封瓶口，观察小鼠活动.在缺氧环境中，小鼠活动受氧气限制，持续一段时间后，会发生缺氧表现.以小鼠静卧3 min为界，将记录小鼠从进入瓶中到静卧前的时间记为耐缺氧时间[15-16].

1.4 数据统计分析

试验数据均用SPSS 17.0软件进行t检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著.

2 结果与分析

2.1 衰老动物模型的建立

亚急性衰老小鼠模型建立前后指标变化见图1～4.建模前CK(0)与模型组小鼠相比在体质量、SOD和CAT活性以及MDA含量上几乎一致，均无显著性差别.模型组小鼠通过颈部皮下注射D-半乳糖42 d后，与对照组相比，小鼠体质量降低明显，衰老小鼠体内血液中SOD和CAT 2种酶活性显著降低，MDA含量显著升高，所有检测指标均存在极显著性差异(P<0.01)，视为亚急性衰老小鼠建模成功.建模成功的小鼠身体瘦弱、毛色枯黄、行动迟缓、反应迟钝、精神萎靡.

2.2 小鼠衰老试验中纹党多糖和红芪多糖浓度的筛选

不同浓度的纹党多糖(CCP)和红芪多糖(CHP)对小鼠衰老指标的影响见图5～12.CCP和CHP均能促进正常小鼠血清中的SOD和CAT活力，降低血清中的MDA含量，50、100 mg/kg的剂量处理与CK0组相比均无显著差异(P>0.05)，200 mg/kg剂量处理与CK0组相比存在显著差异(P<0.05)，400、600 mg/kg剂量处理与CK0组相比都存在极显著差异(P<0.01)，400、600 mg/kg的CCP和CHP剂量处理之间比较均无显著性差异(P>0.05)，这说明，400、600 mg/kg的CCP和CHP剂量对正常小鼠的衰老指标影响差异不大.所以将2种中药多糖的剂量筛选为400 mg/kg进行后续的研究.

* P<0.05，** P<0.01.图1 衰老小鼠模型建立前后体质量的变化Figure 1 Changes of body weight of mice before and after model establishment.

* P<0.05，** P<0.01.图2 衰老小鼠模型建立前后SOD酶活性的变化Figure 2 Changes of superoxide dismutase activity of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.图3 衰老小鼠模型建立前后CAT酶活性的变化Figure 3 Changes of catalase activity of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.图4 衰老小鼠模型建立前后MDA含量的变化Figure 4 Changes of malondialdehyde contents of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.图5 纹党多糖对小鼠体质量的影响Figure 5 Effect of CPP on body weight in mice

* P<0.05，** P<0.01.图6 纹党多糖对小鼠SOD酶活性的影响Figure 6 Effect of CPP on superoxide dismutase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.图7 纹党多糖对小鼠CAT酶活性的影响Figure 7 Effect of CPP on catalase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.图8 纹党多糖对小鼠MDA含量的影响Figure 8 Effect of CPP on malondialdehyde contents in mice

* P<0.05，** P<0.01.图9 红芪多糖对小鼠体质量的影响Figure 9 Effect of CHP on body weight in mice

* P<0.05，** P<0.01.图10 红芪多糖对小鼠SOD酶活性的影响Figure 10 Effect of CHP on superoxide dismutase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.图11 红芪多糖对小鼠CAT酶活性的影响Figure 11 Effect of CHP on catalase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.图12 红芪多糖对小鼠MDA含量的影响 Figure 12 Effect of CHP on malondialdehyde contents in mice

2.3 纹党多糖和红芪多糖对衰老小鼠学习记忆能力的影响

CCP和CHP对造模成功后的亚急性衰老小鼠学习记忆能力的影响见图13.衰老小鼠模型组走迷宫所用的学习记忆时间最长，与CK0组相比均呈极显著差异(P<0.01)；连续灌胃VE治疗28 d 后衰老小鼠走迷宫所用的学习记忆时间稍长于CK0组，两者相比无显著差异(P>0.05).衰老小鼠分别用400 mg/kg CCP和CHP连续灌胃给药28 d后，小鼠走迷宫所用的学习记忆时间逐渐缩短，与模型组相比均差异显著(P<0.05)，与VE组和CK0组相比小鼠所用的学习记忆时间均存在极显著差异(P>0.01)，虽然CCP对衰老小鼠学习记忆能力的治疗效果优于CHP，但两者间无显著性差异(P>0.05).CCP和CHP联合灌胃给药28 d后，小鼠所用的学习记忆时间与模型组相比存在极显著差异(P<0.01)，与VE组和CK0相比没有显著差异(P>0.05).以上结果表明，CCP对亚急性衰老小鼠学习记忆能力具有较好的恢复作用，且效果优于CHP，而CCP和CHP联合用药对亚急性衰老小鼠恢复学习记忆能力作用最明显，与VE组无差异.

与CK0组比较，* P<0.05，** P<0.01，与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01，与VE组比较，☆ P<0.05，☆☆ P<0.01.Compared with CK0 group,* P<0.05,** P<0.01,compared with modle group,# P<0.05,## P<0.01，compared with VE group,☆ P<0.05,☆☆ P<0.01.图13 纹党多糖和红芪多糖对衰老小鼠学习记忆时间的影响Figure 13 Effects of CPP and CHP on The time of learning and memory in aging mice

2.4 纹党多糖和红芪多糖对衰老小鼠抗疲劳作用和常压耐缺氧的影响

CCP和CHP对造模成功后的亚急性衰老小鼠抗疲劳作用和常压耐缺氧的影响见图14.衰老小鼠模型组游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间都最短，与CK0组相比均呈极显著差异(P<0.01)；连续灌胃VE治疗28 d 后衰老小鼠游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间稍短于CK0组，与CK0相比均无显著差异(P>0.05).衰老小鼠分别用400 mg/kg CCP和CHP连续灌胃给药28 d后，小鼠游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间逐渐延长，与模型组小鼠相比均存在差异显著(P<0.05)，而与VE组和CK0组相比无显著差别(P<0.05).虽然CCP对衰老小鼠游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间均有延长作用，且效果优于CHP，但两种多糖处理间无显著性差异(P>0.05).CCP和CHP联合灌胃给药28 d后，小鼠游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间与模型组相比存在极显著性差异(P<0.01)，而与VE组和CK0相比无显著性差异(P>0.05).以上结果表明，CCP和CHP对造模成功后的亚急性衰老小鼠抗疲劳作用和常压耐缺氧具有显著的延长作用.

与CK0组比较，* P<0.05，** P<0.01，与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01，与VE组比较，☆ P<0.05，☆☆ P<0.01.Compared with CK0 group,* P<0.05,** P<0.01,compared with modle group,# P<0.05,## P<0.01 compared with VE group,☆ P<0.05,☆☆ P<0.01.图14 纹党多糖和红芪多糖对衰老小鼠抗疲劳作用和常压耐缺氧的影响Figure 14 Effects of CPP and CHP on anti-fatigue and hypoxia tolerance time in aging mice

3 讨论与结论

D-半乳糖在动物体内能转化成醛糖和过氧化氢，引起动物机体产生氧化应激损伤，同时对动物基因的表达和调控产生影响，导致细胞转录水平降低而引起衰老[15-17]，是目前广泛用于动物衰老模型建立的氧化损伤性致衰剂[18-19].本研究采用D-半乳糖构建亚急性衰老小鼠模型.小鼠在D-半乳糖的致衰作用下，产生了大量的自由基，破坏生物膜的完整性，使生物膜的功能产生障碍，导致脂褐素堆积，膜的自由基清除能力下降，引起小鼠的衰老和死亡，最主要的表现就是小鼠体内SOD和CAT活性受抑，导致MDA含量的急剧升高，体质量降低.这几个指标是检测小鼠衰老的的主要指标，也是衰老动物模型建立成功与否的关键检测指标.通过对小鼠颈部皮下注射D-半乳糖建模6周后，小鼠身体瘦弱、毛色枯黄、行动迟缓、反应迟钝、精神萎靡，小鼠血液中SOD和CAT 2种酶活性显著降低，MDA含量显著升高，所有检测指标均存在极显著性差异，所以视为亚急性衰老小鼠建模是成功的.

用纹党和红芪加工废弃物中提取的活性多糖对亚急性衰老小鼠模型进行学习记忆能力和抗疲劳作用研究.先确定分别用400 mg/kg CCP和CHP对衰老小鼠进行灌胃给药，连续灌胃给药28 d后，衰老小鼠体质量恢复明显，小鼠走迷宫所用的学习记忆时间逐渐缩短，小鼠游泳时间、爬杆时间和耐缺氧时间逐渐延长，这说明CCP和CHP 2种多糖对亚急性衰老小鼠学习记忆能力具有较好的恢复作用，能显著提高衰老小鼠的抗疲劳作用和常温耐缺氧时间，整体的治疗效果CCP优于CHP，且发现用相同浓度的CCP和CHP联合对衰老小鼠灌胃治疗后，小鼠很好地恢复了学习记忆能力、抗疲劳作用和常温耐缺氧时间也逐渐增长，治疗作用最为明显，与VE组相比无差异.说明CCP和CHP均能提高衰老小鼠的抗疲劳作用，而且CCP和CHP联用效果最好.

纹党和红芪加工废弃物中活性多糖能够有效地缓解和改善小鼠衰老，虽然两种多糖的抗衰老和恢复学习记忆能力的作用没有VE强烈，但作用比较持久和温和.