奶牛乳脂合成及其关键基因的调控作用

焦蓓蕾， 田 茂， 杨春生， 李文敏， 杨爱芳， 王 静， 贺永强*, 亮 玲

(1.内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古 和林格尔 011500；2.内蒙古爱养牛科技有限公司，呼和浩特 010000)

牛奶是家庭日常食谱中保健养生的高级营养品，之所以拥有这么优秀的饮用价值离不开其丰富的营养成份。乳脂，作为保证乳制品感官品质、营养质量水平的重要组成之一，其所含的脂肪酸(fatty acid，FA)，如：油酸和亚麻酸在抗血管动脉粥样硬化方面起到了有效的预防作用[1]，在每100 g牛奶中约含3.2 g的脂肪，在人体的消化率高达95%以上。此外，乳脂是人体必需FA、磷脂(phospholipid)以及脂溶性维生素的重要来源[2]，为人体提供大量的营养与能量。

乳脂的主要成分是甘油三酯，由不同种类和数量的脂肪酸构成。长链脂肪酸(long-chain fatty acid，LCFA)主要是在血液中转运并被乳腺重新吸收合成；短链(short chain fatty acid，SCFA)或中链脂肪酸(medium-chain fatty acid，MCFA)是在乳腺内从头合成。通过大量的研究试验以及理论综述，发现影响奶牛乳脂合成的主要因素大致分为4种：饲养管理因素、营养因素[3-4]、遗传育种因素以及内分泌因素。

近年来，功能基因组学的研究强调了哺乳动物乳腺组织的泌乳复杂性，揭示了泌乳中潜在多个基因及其所形成关系网络的转录作用与调控机制[5]。通过分子生物学对乳脂合成的深入研究已揭示出在血液中脂肪酸的摄取、细胞内脂肪酸活化与通路、脂肪酸的从头合成与去饱和作用、三酰基甘油合成、脂滴膜的形成等过程中关键基因及其信号通路的调控作用[6-8](详见表1)。本文通过对脂肪酸的摄取与转运、脂肪酸的内源合成、酮体的利用、三酰甘油和磷脂合成、酯化和脂滴形成等过程中相关基因的主要功能、激素(基因)的调控机制进行归类与综述性探讨，旨在归纳出调控奶牛乳脂合成的关键基因，为在奶牛的分子水平上影响奶牛乳脂合成的调控机制提供详细的理论依据。

1 乳脂的合成与分泌机理

1.1 乳脂的合成

乳脂的主要组成成分是甘油三酯(triacylglycerol，TAG)，占乳脂总量的95%～98%，其次是二酰甘油、磷脂、胆固醇以及小部分的游离脂肪酸(FFA)、共轭亚油酸、神经鞘磷脂、丁酸和醚脂类物质等活性物质[9]。TAG是乳脂的主要成分，是由3个脂肪酸酯化到甘油-3-磷酸骨架上形成的。反刍家畜中用于合成脂肪酸的来源主要有两种：一种是在乳腺上皮细胞中从头合成；另一种是从血液中吸收而来(碳元素大于16的长链脂肪酸)。反刍动物乳腺中乳脂的合成有1/2是来自于奶牛每天的饲喂饮食，其余的乳脂主要是由乳腺细胞自身合成[10]：少于C16的中链或短链脂肪酸直接在乳腺上皮细胞上从头合成；于C16 (包括C16 (软脂酸))的长链脂肪酸从血液进入到乳腺上皮细胞中。

乳腺上皮细胞的从头合成过程：反刍动物的瘤胃发酵的乙酸和β-羟丁酸(BHBA)作为底物[11]，在乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha，ACACA)的催化下生成乙酰辅酶A(acetyl coenzyme，Acyl-CoA，乙酰-CoA)，进入乳腺上皮细胞后，BHBA转化为丁酰CoA，随后在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)的作用下为碳链的延长提供碳原子(以2C单位延长碳链)，当脂酰链合成达到C16时，转酰基酶开始参与并终止碳链延长(脂酰链的合成)[12]。

血液的乳脂合成过程：首先，奶牛日粮中的脂肪被水解成非酯化脂肪酸，瘤胃微生物将这些日粮脂肪还原为饱和脂肪酸，该过程主要把硬脂酸(C18∶0)(一部分)酯化形成极低密度脂蛋白(very-low density lipoprotein，VLDL)；随后，VLDL在十二指肠内被吸收、释放到血液中；最后，VLDL被乳腺中重新摄取后再次分解，VLDL去饱和后形成TAG[13]。

1.2 乳脂的分泌

乳脂的主要分泌形式是乳脂球，从头合成途径的脂酰辅酶A以及外源摄取的脂肪酸在滑面内质网上通过酯化反应结合到甘油-3-磷酸骨架上形成TAG。在乳脂分泌的过程中，小脂滴的形成来源于在内质网双分子层膜间形成TAG。在乳脂滴的分泌过程中，有些脂滴直接移到乳腺上皮细胞的顶端等离子体膜上，而部分脂滴是先形成大的脂滴后，再移动到等离子体膜上，最后细胞膜包裹乳脂滴释放到细胞外。此外，脂滴也可以通过分泌小泡的形成胞质液泡，在乳腺上皮细胞顶膜上通过胞吐作用释放脂滴[14]。

2 乳脂合成与分泌过程中相关蛋白、酶的调控[6]

奶牛乳脂的合成与分泌过程中，不同种类与数量的脂肪酸使牛奶中含有了不同分子量和饱和度的甘油三酯，也就是乳脂。乳脂合成中前体物的运输、TAG的合成与转运、脂滴的合成与分泌等过程需要多个关键的转移蛋白、酶、调控因子的相互作用。

2.1 长链-CoA的生成(脂肪酸的从头合成、LCFA被运输到乳腺细胞内)

2.1.1 ACSL1和FABP3协同促进长链CoA的生成 在ACACA和FASN的协同作用下，利用乙酰-CoA和丁酰辅酶a来促进脂肪酸的从头合成。乙酰-CoA在由酰基辅酶a激酶2(ACSL2)所携带的醋酸盐中形成。脂肪酸合成过程中，碳元素在10个以上时会被合成长链的酰基辅酶a激酶1(ACSL1)激活后再结合到脂肪酸结合蛋白3(fatty acid-binding protein 3，FABP3)上，促使合成长链CoA。

2.1.2 胞外的LCFA在ACSL1和FABP3的作用下生成长链CoA 在极低密度脂蛋白受体(very-low density lipoprotein receptor，VLDLR)的协助下，细胞内的脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)将VLDL和TAG水解后释放出LCFA 到胞外；随后，LCFA在蛋白-调节机制的引导作用下进入乳腺细胞内。整个蛋白—调节机制中，CD36分子是调控LCFA运输的最关键因子；当LCFA通过细胞膜进入乳腺细胞后，在ACSL1的激活作用下形成长链-CoA，长链-CoA在FABP3的捕捉作用下被运输到特定的细胞内。长链-CoA的激活，本质上就是将LCFA困在乳腺细胞内为TAG的合成做准备。

2.2 LCFA或长链-CoA被FABP3捕捉运输

FABP3捕捉LCFA或长链-CoA后会将其作为硬酯酰CoA去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)，SCD)的底物，在FABP4的转运作用下参与TAG的合成。TAG合成过程中有3个关键转移酶参与调控：①在三酰基甘油固醇酰基转移酶6(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6，AGPAT6)的作用下将长链-CoA转移至溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)sn-2位置上并生成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)；②在类脂1(lipin 1，LPIN1)的作用下将PA的磷酸基团酶解生成二酰甘油(diacylglycerol，DAG)；③在二酰甘油酰基转移酶1(diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1)的作用下将长链-CoA转移至DAG sn-3位置上生成TAG。因此，LCFA或长链-CoA可直接作为原料参与TAG的合成。

2.3 XDH、ADFP和BTNIAI参与脂滴的生成

在奶牛乳腺上皮细胞中，形成的TAG会在乳腺细胞的小叶内形成脂滴并在脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation related protein，ADFP)(圆形的黄色)与嗜乳脂蛋白(BTNIAI)(半月形的棕色)在作用下参与脂滴的形成与分泌途径。除此之外，在乳脂滴的分泌途中，黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase，XDH)也起到了协助导向的作用，但目前为止XDH的具体协同作用机制尚未可知[6]。

2.4 TAG合成过程中的转录调节作用

过氧化物酶体増殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)在FABP3捕捉LCFA或长链-CoA的运输过程中起到非常重要的转录调节的作用。参与脂肪酸转运的基因包括LPL、CD36和ACSL1是PPARγ基因的靶向调控基因[6]。研究表明，PPARγ激活剂1α(PPAR gamma，coactivator 1 alpha，PPARγC1A)和LPIN1是PPARγ的辅助因子，在哺乳期间，基因PPARγC1A和LPIN1的表达上调促使PPARγ在调控脂质代谢过程中起到关键的调控作用[15-16]。

参与脂肪酸从头合成的基因受固醇调节元件结合蛋白1(sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP1)的调控，SREBP1属于核转录因子家族，是调控胆固醇和脂肪酸从头合成基因表达的重要转录调节因子。大量研究表明，在小鼠[17]和奶牛[18]的乳脂合成中，SREBP1和SREBP2能够通过激活ACACA、FASN、VLDLR、胰岛素诱导因子1(insulin induced gene 1，INSIG1)等有关乳脂合成基因的表达来调控TAG的合成过程。

3 调控乳脂关键基因的研究进展

目前，通过对奶牛乳腺组织中各个基因的表达研究，已经建立了涉及脂肪酸合成与运输、脂滴形成、酮体利用以及转录调控相关基因的表达，如表1所示[19]。

表1 奶牛乳脂合成过程中相关基因信息

3.1 LPL

脂肪被乳腺细胞吸收是乳脂产生的关键。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)是血脂代谢的中心分子，其主要功能是以同源二聚体的形式作为TAG的水解酶以及作为配体介导脂蛋白摄入的双重功能。当血液流经乳房时，LPL将血液中的VLDL或乳糜微粒固定在乳腺内皮细胞上，通过水解作用将脂蛋白所携带的TAG水解成甘油和脂肪酸，再被乳腺组织吸收利用，合成乳脂[28]。与其他组织相比，乳腺中的LPL基因具有更高的表达活性，研究证明，早在牛奶合成之前，LPL基因的表达量就已经开始显著上调[6]。在小鼠研究中发现，乳腺组织中LPL基因的表达水平从孕期到泌乳期增加了2倍之多[28]，并在泌乳期能持续保持高水平的表达量，而奶牛乳腺LPL基因的表达模式与泌乳曲线非常相似，这可能表明LPL基因在维持牛奶合成的过程中具有重要作用；同时，LPL还通过与VLDLR结合，增强乳腺细胞富集脂蛋白的能力[29]。因此，LPL是决定脂肪细胞的大小程度与脂肪蓄积的重要标志。

3.2 CD36

分化抗原簇36(CD36)也称为清道夫受体B2、脂肪酸转移酶(fatty acid translocase，FAT)，是介导LCFAs整个跨膜转运与脂肪酸吸收利用的限速因子。研究证明，超过90%的胞外LCAFs是通过膜转运蛋白进入细胞的。

CD36/SR-B2(cluster of differentiation 36/scavengerreceptor B2)是促进脂肪酸转运的主要膜蛋白之一[30-31]。CD36/SR-B2通过作为脂肪酸的受体，富集并结合相应的脂肪酸后定位在细胞外膜的脂筏结构上；随后脂肪酸的极性羧基从脂质层的胞外转进胞内；最后脂肪酸被释放于细胞内膜进入细胞质，并与FABP结合开始重吸收利用。研究表明，CD36/SR-B2能促进细胞对n-3长链多不饱和脂肪酸的摄取[32]，CD36/SR-B2具有与FABP或ACSL协同促进脂肪酸的摄取与转运的影响作用。

3.3 FABPs

LCFA在细胞内的自由扩散和选择性靶向特定细胞器的过程都需要特定转运体协助，而脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)是奶牛乳腺细胞内主要的脂肪酸转运蛋白。Massimo Bionaz等人通过qPCR技术分析了在分娩前15 d，分娩后15 d，60 d与240 d的荷斯坦奶牛各6头，发现在奶牛乳腺组织中FABP3、FABP4、FABP5基因的表达量较高，而其余亚型几乎检测不到。在奶牛的乳腺发育与泌乳期中，FABP3基因的表达量具有优势地位，在奶牛产后15 d时表达量显著上升，是产前的40倍[33]。此外，FABP3可以通过捕获长链-CoA并转运到特定的胞内细胞器中来捆绑并激活胞内LCFA，以供后期脂肪酸的合成利用[6]。

3.4 ACACA和FASN

在奶牛乳腺上皮细胞中ACACA和FASN是催化脂肪酸从头合成过程的关键酶。ACACA是脂肪酸合成的限速酶，可以催化乙酰CoA生成丙二酸单酰辅CoA，而丙二酸单酰CoA作为LCFA碳链延长的C2供体并促进TAG与磷脂的合成[34]。研究表明，ACACA的表达受多种营养因素、激素及一些转录因子的调控，食物中脂肪的增加和碳水化合物的减少会引起ACACA浓度显著下降，说明ACACA基因的表达量受高碳水化合物食物的影响；胰岛素具有增强三碘甲状腺氨酸促使ACACA基因转录的作用，而胰高血糖素可以抑制胰岛素和三碘甲状腺氨酸对ACACA基因表达的影响[35]。

FASN是一种结合缩合、还原、转酰、脱水等7种活性于一体的大分子蛋白复合物。在反刍动物的脂肪酸合成中，FASN能够影响MCFA的生成和释放。在泌乳期时，FASN在辅酶NADPH的存在下具有催化乙酰CoA和丙二酸单酰辅酶A生成LCFA的作用(如C16)[36]，奶牛乳脂肪酸中大部分是LCFA，而乳脂肪酸的MCFA主要是通过奶牛瘤胃将饲草料的碳水化合物经过酶解发酵后产生乙酸(acetate)和BHBA生成。

3.5 SCD

在反刍动物乳腺中，硬脂酰CoA去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)是可以直接影响脂肪酸的含量和组成、增加不饱和脂肪酸比例的关键酶。SCD通过在饱和脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)的第9和10碳原子间导入氢键，使其分别形成单不饱和脂肪酸油酸和棕榈油酸，是合成膜磷脂、脂肪酸的主要底物。SCD基因的表达及其产物的活性影响多种关键的生理学参数如肥胖症、动脉粥样硬化、糖尿病及高血压等。张蕊等人在关于SCD基因的功能与调控的报道中指出[37]，在高能饲粮条件下饲喂的SCD基因缺陷型小鼠身上发现，其体脂沉积在大大减少，而SCD基因缺失的小鼠不能减轻高脂饮食所带来的肥胖与脂肪肝症状。由于SCD的表达量或者酶活性可以改变细胞内饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例，因此在畜牧生产中，人们通过对SCD的多态性分析进行选种选育。

3.6 CIDEC

在脂肪代谢中DNA断裂因子相似蛋白C(cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector，CIDEC)是调节TAG储存和脂滴大小的关键蛋白。在奶牛研究中，CIDEC存在于泌乳的乳腺组织中，且过表达CIDEC基因会引起奶牛乳腺细胞中TAG的含量和脂滴数的显著增加[38]，CIDEC基因具有正向调节乳脂合成的功能。在CIDEC的功能研究中发现，CIDEC家族因子是可结合在脂滴表面、促进大脂滴生成、脂肪储存的肥胖因子[39]。已有实验证明，在小鼠胚胎成纤维细胞，过表达CIDEC基因可使细胞中产生大量脂滴，而干扰CIDEC基因后的细胞不但抑制其分化功能、脂滴生成，还抑制乳脂分泌[40]。研究表明，CIDEC基因的表达受到2个转录因子的调控——增强子结合蛋白C/EBP及PPARγ。在小鼠的研究中发现C/EBP能结合在CIDEC基因的启动子上并激活其表达，而PPARγ可以靶向CIDEC基因并激活其转录，从而在转录水平上激活与促进CIDEC的表达，调控乳脂的合成[41-42]。

3.7 SREBP1

固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP)在转录水平对脂肪酸和胆固醇的合成起着关键的调节作用[43]。大量的研究表明，在泌乳期间，作为奶牛乳脂合成过程中的关键调控基因——SREBF1能正向调控FASN基因的表达，具有促进奶牛乳脂合成的作用[44]。通过RNA干扰技术沉默奶牛乳腺上皮细胞SREBP1基因后发现，与脂肪酸从头合成关键酶的含量均显著下降并影响了脂肪酸的合成与转录[43]。SREBF1是乳脂合成调控的核心，在FASN、PPARγ、PPARγC1A和INSIG1基因的协同作用中起着举足轻重的作用。

3.8 PPARs

乳腺组织中过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferater-activated receptors，PPARs)是调控脂肪合成与细胞增殖的关键受体，处于脂肪合成的转录调控作用的中心位置。Mani等人研究证明，PPARs可以通过活化脂肪细胞中乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和葡萄糖转运体4(glucose transporter 4，GLUT4)等基因表达，促进脂肪细胞中ATG的合成増加[44]。

妊娠期小鼠及泌乳牛的乳腺发育研究表明，PPARγ基因的表达明显上调[6-7,44]。Graugnard证明了在反刍动物体内，PPARγ是主要的脂肪合成调控因子，主要是通过与乳脂合成的关键基因，如：ACC、FASN、LPIN1、SREBP、INSIG1、SCD等靶向结合而影响LCFA的代谢[33]。刘莉莉等人[45]通过探究PPARγ对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成相关基因表达的影响研究发现：沉默或超表达PPARγ，不仅可以调控脂肪酸从头合成酶基因(ACC、FAS)，脂肪酸的摄取、转运相关蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1)，还能影响DCMECs甘油三酯合成的关键酶的表达。其中，在非反刍动物的乳脂研究中，CD36和ACSL1已被验证是PPARγ基因的已知靶基因[46]。PPARγ既能影响DCMECs转录调控因子的基因表达，还能调节乳脂肪合成过程中其它相关蛋白，PPARγ是奶牛乳脂肪合成的关键调控因子，能直接或通过激活转录调节因子SREBP1而调控乳脂肪合成[47]。

4 结 语

通过激素(催乳素、孕激素等)协同作用所产生的激素—激素受体—信号网络通路来调控乳腺发育以及乳脂的合成，营养素、生长因子、激素等信号会刺激与乳腺细胞增殖、乳脂合成及泌乳相关基因的表达。从血液中FA的主动摄取(如LPL、CD36基因)以及细胞内与乳脂合成、运输等相关基因的表达显著上调(如FABP3基因)是奶牛泌乳的关键特征。奶牛的泌乳行为诱导了参与FA激活(如ACSL1基因)、从头合成(如ACACA、FASN基因)、去饱和(如SCD基因)、脂滴形成(如BDH1、OXCT1基因)等过程中关键基因mRNA的表达上调。在奶牛产后60 d左右，参与乳腺脂质合成过程中具有关键作用的调控基因表达达到高峰，并持续跟随奶牛的泌乳曲线而呈现曲线表达模式[6]。本文从乳脂合成与分泌、关键调控蛋白与基因的层面系统的阐述了影响乳脂合成的因素，并归纳出最新的影响乳脂合成相关基因信息表，力图通过在分子生物学领域内为深入研究乳脂合成相关基因的表达与信号网络的调控机制提供研究依据。